烷基胺改进甲醛固定的生物样品组分的检测制造技术

本发明专利技术涉及烷基胺改进甲醛固定的生物样品组分的检测。烷基胺起作用以释放在生物样品中发生的甲醛交联。因此，将烷基胺接触甲醛固定的样品是可以用于使得样品的生物组分，包括核酸或蛋白质更易于检测和表征的方法。

【技术实现步骤摘要】
本申请是国际申请日为2008年3月26日的国际申请PCT/EP2008/002356进入中国、申请号为200880010876.7的题为“烷基胺改进甲醛固定的生物样品组分的检测”的专利技术专利申请的分案申请。
和
技术介绍
在过去的100年中，病理学家已经常规地通过用甲醛固定生物样品来保存它们如组织。虽然甲醛处理保持了组织的细胞特征，但甲醛处理也会导致化学交联，这使得样品的许多生物组分不能充分适于或不适于检测、量化和表征。甲醛通过使蛋白质中的伯胺基团与蛋白质或DNA中的其它附近的氮原子通过-CH2-键交联，而保存或固定组织或细胞。因此，例如尽管聚合酶链式反应(PCR)可用于检测和量化生物样品中的核酸，但PCR通常不能充分地或不能有效地分析甲醛交联的样品中的核酸，特别是在期望定量结果时。因此，在甲醛的作用下核酸交联到细胞组分对检测各种细胞组分提出了挑战、包括检测核酸和蛋白质。虽然已经描述了一些途径用于改进从甲醛交联的样品扩增核酸，但该改进通常仅仅包括降解样品中的蛋白质或提供通常不改变形成交联的共价键的洗涤剂。本专利技术解决这个及其他问题。
技术实现思路
本专利技术提供了用于分析甲醛交联的生物样品的一种或多种组分的方法。在一些实施方案中，该方法包括使样品与充足量的烷基胺接触，以释放至少一部分交联的组分，从而改进用于分析的一种或多种组分的可检测度(accessibility)。在一些实施方案中，生物样品来自动物的组织样品。在一些实施方案中，烷基胺的量在0.01％(约2mM)至5％(约800mM)之间。在优选的实施方案中，样品和烷基胺被加热一段时间。在一些其它的优选的实施方案中，该方法进一步包括检测组分。在一些实施方案中，在检测步骤之前，将烷基胺基本上从样品中除去。在一些实施方案中，在检测步骤前，烷基胺的浓度降低至小于约0.5％(约80mM)(例如小于约0.2％或0.1％)。在一些实施方案中，检测步骤包括定量检测组分。在一些实施方案中，组分是核酸。在一些实施方案中，核酸是DNA。在一些实施方案中，组分是RNA。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测核酸。在一些实施方案中，检测步骤包括扩增核酸。在一些实施方案中，在允许形成探针和核酸的条件下，使核酸组分接触探针，并且检测双链体的存在。在一些实施方案中，探针连接到固相载体上。在一些实施方案中，扩增步骤包括聚合酶链式反应。在一些实施方案中，组分是蛋白质。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测蛋白质。在一些实施方案中，检测步骤包括质谱或电泳。在一些实施方案中，质谱包括基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)。在一些实施方案中，在接触步骤前，样品被包埋在石蜡中。在一些实施方案中，烷基胺选自乙二胺、乙醇胺和丙胺。在一些实施方案中，与如果不进行接触步骤可用于分析的部分相比，可用于分析的组分的部分被提高到至少约两倍。在一些实施方案中，与如果不进行接触步骤可用于分析的部分相比，可用于分析的组分的部分被提高到至少约十倍。在一些实施方案中，该方法进一步包括使样品与蛋白酶接触以降解样品中的蛋白质，从而使得核酸更可用于分析。本专利技术还提供了试剂盒，其用于改进甲醛交联的生物样品的一种或多种组分的利用度。在一些实施方案中，该试剂盒包括烷基胺；和用于从生物样品除去烷基胺的设备，例如蛋白酶或试剂或设备。在一些实施方案中，该试剂盒包括用于从生物样品除去烷基胺的试剂或设备。在一些实施方案中，该设备是用于纯化核酸的柱。在一些实施方案中，该试剂盒包括蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶是蛋白酶K。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包括核苷酸和/或热稳定聚合酶。在一些实施方案中，热稳定聚合酶是Taq聚合酶。本专利技术还提供了反应混合物。在一些实施方案中，反应混合物包括甲醛交联的生物样品；和充足量的烷基胺以释放至少一部分交联的组分。在一些实施方案中，烷基胺的量在0.01％至5％之间。在一些实施方案中，烷基胺选自乙二胺、乙醇胺和丙胺。在一些实施方案中，生物样品来自动物的组织样品。定义“甲醛交联的生物样品”是指已经被甲醛处理成在蛋白质中的氮与其他含氮的蛋白质和/或核酸之间形成交联的生物样品。生物样品典型地包含细胞。生物样品可以是例如，来自动物的组织样品。通过将它们包埋在石蜡中而存储许多甲醛处理的样品。如本文中使用的，术语“烷基胺”是指直或支链的、饱和或不饱和的分子，其具有1-10或更多碳原子和一个或多个氨基。烷基胺的烷基部分可以是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。氨基可以是伯氨基或仲氨基。烷基胺可进一步被不大于2(即0、1或2)个取代基取代，其包括但不限于一个或多个羟基基团。可用于本专利技术的烷基胺包括但不局限于乙胺、丙胺、异丙胺、乙二胺和乙醇胺。本领域技术人员会理解其它烷基胺也可用于本专利技术。短语“检测组分”是指至少测定组分的存在或不存在，并可以包括组分或部分组分的进一步定量测定或其它表征。生物样品的“组分”是指一类分子(例如蛋白质、核酸等)或人们希望检测的具体的目标如具体的蛋白质或核酸序列。如本文中使用的，术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸的聚合物(包含2-脱氧-D-核糖)(即DNA)、多核苷酸(包含D-核糖)(即RNA)和任何其它嘌呤或嘧啶碱类的N-糖苷类似物、或经修饰的嘌呤或嘧啶碱基。短语“以释放至少一部分交联的组分”是指改变在生物样品的两种组分(例如核酸和蛋白)指尖形成交联的共价键，以便这两种组分不再通过共价键连接。该短语包括但不限于完全逆转交联过程。如本文中使用的，短语“用于分析的可检测度”是指测定特定的靶分子存在或不存在和/或量的检测方法。例如许多检测方法为至少部分阻止检测甲醛交联的生物样品中的蛋白质或核酸，因此某些交联的组分不″可用于″检测。一旦通过用烷基胺处理释放交联，则组分的提高量(例如至少多约10％和典型地是至少约2倍，或有时是约至少10或100倍)可以被检测和定量测定。附图说明图1描绘了核酸甲醛交联到赖氨酸以及在添加烷基胺后交联逆转的实例。图2描绘了实施例1中所述未经处理的低聚核苷酸的质谱分析。图3描绘了实施例1中所述福尔马林处理的低聚核苷酸的质谱分析。图4描绘了实施例1中所述福尔马林处理的低聚核苷酸和赖氨酸的质谱分析。图5描绘了如实施例1中所述使用乙醇二胺(et本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于分析甲醛交联的生物样品的一种或多种组分的方法，该方法包括：(1)在室温下，将样品与充足量的选自乙二胺、乙醇胺和丙胺的烷基胺接触以释放至少一部分交联的组分，从而提高一种或多种组分对于分析的可检测度；(2)在检测步骤之前，将烷基胺基本上从样品中除去；和(3)检测组分，其中组分是核酸。

【技术特征摘要】
2007.03.30 US 60/920939;2007.08.08 US 60/9547211.用于分析甲醛交联的生物样品的一种或多种组分的方法，该方
法包括：
(1)在室温下，将样品与充足量的选自乙二胺、乙醇胺和丙胺的
烷基胺接触以释放至少一部分交联的组分，从而提高一种或多种组分
对于分析的可检测度；
(2)在检测步骤之前，将烷基胺基本上从样品中除去；和
(3)检测组分，
其中组分是核酸。
2.权利要求1的方法，其中烷基胺的量在2mM至800mM之间。
3.权利要求1的方法，其中在检测步骤之前，将烷基胺的浓度降
低至小于80mM。
4.权利要求1的方法，其中检测步骤包括扩增核酸。
5.权利要求1的方法，其中在允许形成探针和核酸的条件下，使
核酸组分接触探针，并且检测双链体的存在。
6.权利要求1的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·G·威尔，V·博德普迪，E·H·菲斯，R·沙希尼安，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH