一种检测溶液或细胞中10制造技术

本发明专利技术一种检测溶液或细胞中10

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属分析化学领域，具体地说是一种用荧光、紫外-可见吸收检测微量H2O2及细胞成像的探针方法。
技术介绍
生物相关分子、离子的识别检测在生命、健康及环境研究中尤为重要。小分子荧光探针具有结构简单、合成简便、成本低廉、水溶性好、对细胞毒性小等优点，将其应用于生物体系的分子、离子检测具有灵敏度高、选择性好、可视性强、快速、简便的特点。H2O2在体内继续分解生成超氧阴离子O2-等多种自由基，参与生物细胞的衰老过程，在病理条件、慢性病及正常生理过程中发挥着关键作用。过氧化氢进入人体后极易转变成羟基自由基（×OH），这是目前所知活性氧中对生物毒性最强、危害最大的一种自由基，可以直接或间接氧化细胞内大分子（如核酸、蛋白），破坏细胞膜结构，加速细胞衰老与凋亡，对人体产生极大的危害。有关过氧化氢的测定研究日益受到重视，建立过氧化氢的准确测定方法，从而有效控制过氧化氢的投放量和残留量显得尤为重要。目前，过氧化氢的测定主要有电化学法、高效液相色谱法、化学发光法、荧光法、光度法等。其中分光光度法操作简单、直接，得到较广泛的应用。荧光探针与荧光显微技术的结合，使荧光探针在生物活性物质检测和细胞成像方面得到广泛应用。对生物活性物质而言，检出的灵敏度极限是单个分子而对测试技术有更高的灵敏度要求，同时也有更苛刻的测试条件要求。荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。活细胞成像技术是生命科学
中重要的研究手段，与固定细胞研究结合起来，可以解释活细胞中的多种生命现象。
技术实现思路
本专利技术目的在于建立一种荧光探针技术，用荧光和紫外-可见吸收光谱方法高灵敏、高选择性、简便、快速的检测溶液或细胞中低浓度微量H2O2光谱测定方法；用荧光显微镜可视性检测活细胞中H2O2的探针成像方法。本专利技术一种检测溶液或细胞中10-7~10-5M低浓度H2O2的方法是以化合物(E)-2-(2,4-二羟基苯基)乙烯基-8-羟基喹啉为检测H2O2的荧光或比色探针试剂，简称探针，其结构如下：检测方法为：在乙腈/H2O（v/v，3/2，pH11）介质中（1）荧光光谱法检测H2O2，以415nm为激发波长，测定探针在580nm处的荧光强度降低随H2O2浓度变化，用校正曲线法检测；（2）紫外吸收光谱法检测H2O2，测定探针在410nm处的吸光度降低随H2O2浓度变化，用校正曲线法检测；（3）利用探针的颜色变化目视检测H2O2：日光下探针溶液颜色随H2O2的加入由橙红色变为无色；在365nm紫外灯下探针溶液发射荧光颜色随H2O2的加入由橙红色变为无色；（4）在活细胞内利用H2O2使探针的荧光猝灭，用荧光成像可视检测细胞内H2O2。所述的一种检测溶液或细胞中10-7~10-5M低浓度H2O2的方法是在浓度为10μM探针的乙腈/H2Ov/v，3/2，pH=11溶液中，用荧光或紫外-可见吸收法检测H2O2，检测时反应时间控制在20~30min。所述的一种检测溶液或细胞中10-7~10-5M低浓度H2O2的方法是探针荧光和紫外-可见吸收法检测H2O2时，其它共存氧化剂或还原剂：NO3-，NO2-，t-BuOOH（过氧化氢叔丁醇），ClO-，GSH（谷胱甘肽），O2-，t-BuO×（叔丁氧基自由基），×OH（羟基自由基）在浓度与H2O2相同时，不干扰探针对H2O2的测定。所述的一种检测溶液或细胞中10-7~10-5M低浓度H2O2的方法是探针用荧光法检测H2O2的浓度线性范围为8.3×10-7~4.3×10-5M，检测限为2.3×10-8M；紫外-可见吸收法检测H2O2的浓度线性范围为8.5×10-7~5.2×10-5M，检测限为8.9×10-7M。所述的一种检测溶液或细胞中10-7~10-5M低浓度H2O2的方法是所述探针的荧光成像检测活性细胞内H2O2方法为：活性PC3细胞经复苏、传代、接种、培养、清洗后，将细胞浸入pH值为11的含10mM探针的培养液，在37℃，5%CO2以及饱和湿度为100%的培养箱中孵育1h，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞，用荧光显微镜检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像；再将上述细胞浸入含20mMH2O2的培养液中孵化10min后，吸出含H2O2的培养液，用新鲜培养基清洗细胞3次，用荧光显微镜检测，观察到微弱的红色荧光细胞图像；再经H2O2孵化30min后，用荧光显微镜检测，观察不到细胞的荧光图像。所述的一种检测溶液或细胞中10-7~10-5M低浓度H2O2的方法是所用的试剂为分析纯或生化试剂，所用水为二次蒸馏水或生理盐水；所用活性PC3细胞为人体前列腺癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。本专利技术一种检测溶液或细胞中10-7~10-5M低浓度H2O2的方法有别于其他H2O2的测定方法：（1）探针可同时用于荧光和紫外-可见吸收法检测，方法简便、快速灵敏，无需加入过多试剂；（2）荧光光谱法检测H2O2的检出限低至2.3×10-8M，且不受常见氧化物或还原物的干扰。检测方法不仅适宜在生物样品、极小体系等特殊环境中使用，而且便于荧光成像应用；（3）不仅可用于荧光和吸收光谱定量及目视法定性检测H2O2，用于荧光成像可视化检测活细胞中H2O2；（4）测量方式多样，应用前景好；（5）可用于低浓度微量H2O2的定性定量分析；（6）本专利技术所选用的探针试剂是用于溶液或细胞中H2O2定性定量的最新试剂。附图说明图1探针与氧化剂或还原剂作用的荧光光谱图：在浓度为10μM的探针的乙腈/H2O（v/v，3/2，pH11）溶液中，分别加入氧化剂或还原剂：1mM的NO3-、NO2-、t-BuOOH（过氧化氢叔丁醇）、ClO-；0.5mM的GSH（谷胱甘肽）、O2-；100mM的t-BuO×（叔丁氧基自由基）、×OH(羟基自由基)，反应30min后，没有观察到荧光光谱明显的变化；而加入50μM的H2O2反应30min后，探针在580nm处的荧光峰猝灭。表明在此条件下探针仅对H2O2有识别检测作用。激发波长为415nm。图2探针与氧化剂或还原剂在不同作用时间的荧光强度变化图：在浓度为10μM的探针的乙腈/H2O（v/v，3/2，pH11）溶液中，分别加入氧化剂或还原剂：1mM的NO3-、NO2-、t-BuOOH（过氧化氢叔丁醇）、ClO-；0.5mM的GSH（谷胱甘肽）、O2-；100mM的t-BuO×（叔丁氧基自由基）、×OH(羟基自由基)，分别反应1min、5min、10min、30min后，没有观察到荧光光谱明显的变化；而加入50μM的H2O2反应30min后，探针在580nm处的荧光峰猝灭，表明在此条件下探针仅对H2O2有识别检测作用。激发波长为415nm。图3探针与氧化剂或还原剂作用的紫外-可见吸光谱图：在浓度为10μM的探针的乙腈/H2O（v/v，3/2，pH11）溶液中，分别加入氧化剂或还原剂：1mM的NO3-、NO2-、t-BuOOH、ClO-；0.5mM的GSH、O2-；100mM的t-BuO×、×OH，反应30min后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测溶液或细胞中10‑7~10‑5M低浓度H2O2的方法，其特征是以化合物(E)‑2‑(2,4‑二羟基苯基)乙烯基‑8‑羟基喹啉为检测H2O2的荧光或比色探针试剂，简称探针，其结构如下：检测方法为：在乙腈/H2O v/v，3/2，pH 11介质中（1）荧光光谱法检测H2O2，以415nm为激发波长，测定探针在580nm处的荧光强度降低随H2O2浓度变化，用校正曲线法检测；（2）紫外吸收光谱法检测H2O2，测定探针在410nm处的吸光度降低随H2O2浓度变化，用校正曲线法检测；（3）利用探针的颜色变化目视检测H2O2：日光下探针溶液颜色随H2O2的加入由橙红色变为无色；在365nm紫外灯下探针溶液发射荧光颜色随H2O2的加入由橙红色变为无色；（4）在活细胞内利用H2O2使探针的荧光猝灭，用荧光成像可视检测细胞内H2O2。

【技术特征摘要】
1.一种检测溶液或细胞中10-7~10-5M低浓度H2O2的方法，其特征是以化合物(E)-2-(2,4-二羟基苯基)乙烯基-8-羟基喹啉为检测H2O2的荧光或比色探针试剂，简称探针，其结构如下：
检测方法为：在乙腈/H2Ov/v，3/2，pH11介质中（1）荧光光谱法检测H2O2，以415nm为激发波长，测定探针在580nm处的荧光强度降低随H2O2浓度变化，用校正曲线法检测；（2）紫外吸收光谱法检测H2O2，测定探针在410nm处的吸光度降低随H2O2浓度变化，用校正曲线法检测；（3）利用探针的颜色变化目视检测H2O2：日光下探针溶液颜色随H2O2的加入由橙红色变为无色；在365nm紫外灯下探针溶液发射荧光颜色随H2O2的加入由橙红色变为无色；（4）在活细胞内利用H2O2使探针的荧光猝灭，用荧光成像可视检测细胞内H2O2。
2.根据权利要求1所述的一种检测溶液或细胞中10-7~10-5M低浓度H2O2的方法，其特征是在浓度为10μM探针的乙腈/H2Ov/v，3/2，pH=11溶液中，用荧光或紫外-可见吸收法检测H2O2，检测时反应时间控制在20~30min。
3.根据权利要求1所述的一种检测溶液或细胞中10-7~10-5M低浓度H2O2的方法，一种检测溶液和细胞中浓度低于10-5MH2O2的方法，其特征是探针荧光和紫外-可见吸收法检测H2O2时，其它共存氧化剂或还原剂：NO3-，NO2-，t-BuOOH（过氧化氢叔丁醇），ClO-，GSH（谷胱甘肽），O2...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾晞，朱勤，牟兰，吴玉田，张红，阮琴，李钊，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52