用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及检测试剂盒，核酸适配体为核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7中的一种；核酸适配体J1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA片段；核酸适配体J3的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的DNA片段；核酸适配体J4的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的DNA片段；核酸适配体J7的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示的DNA片段。该核酸适配体免疫原性小、分子量小、易于保存和标记；可作为检测试剂盒检测人高转移结肠癌细胞株LoVo。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及其筛选方法和应用。
技术介绍
肿瘤转移是癌症致死最重要的原因，而在结肠癌病例中有大于50%的患者发生了肿瘤转移，这些发生了肿瘤转移的患者预后极差，五年生存率只有6%左右。因此，发展特异性的方法检测和治疗结肠癌转移肿瘤对提高这些患者的生存率至关重要。然而，由于缺乏相应的技术获得针对结肠癌肿瘤转移的高特异性和高灵敏度的分子探针，目前对高转移结肠癌的诊断和治疗仍面临巨大挑战。近年来，随着影像学和手术技术的进步，虽然使高转移结肠癌的诊断和治疗取得一定进展，但与高转移结肠癌发生有关的分子机制尚不清楚，因此筛选出它的核酸适配体对于临床检测、肿瘤标志物的鉴定、肿瘤发病机理的发现都有很重要的意义。核酸适配体（aptamer）是通过指数富集配体的系统进化技术（SELEX）筛选得到的,能特异结合靶标的单链寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA）。核酸适配体与抗体功能类似，但是与抗体相比具有更多的优势，例如具有更好的亲和力与特异性；免疫原性小；易化学合成且成本低；可进行基团标记；稳定性好，易于保存等优点。此外，核酸适配体的靶标具有普适性，不仅包括离子、氨基酸、核酸、蛋白质等，而且也可以是完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。因此，核酸适配体具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更好的亲和力与特异性、免疫原性小、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的可用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体及其衍生物，还相应提供前述核酸适配体的筛选方法和在制备用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的检测试剂盒中的应用，提高核酸适配体的筛选效率。本专利技术还提供了一种包括前述核酸适配体的检测试剂盒，检测方便、迅速。为解决上述技术问题，提供了一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体，所述核酸适配体为核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7中的一种；所述核酸适配体J1的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的DNA片段；所述核酸适配体J3的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示的DNA片段；所述核酸适配体J4的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示的DNA片段；所述核酸适配体J7的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示的DNA片段。上述的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体还包括在核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。上述的核酸适配体，优选的，所述氨基化具体为在所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7核苷酸序列的5’端标记氨基基团-NH2。上述的核酸适配体，优选的，所述巯基化具体为在所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7核苷酸序列的5’端标记巯基基团-SH。上述的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4和核酸适配体J7的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。上述的核酸适配体，优选的，所述荧光物质为FAM荧光基团或Cy5荧光基团；所述纳米发光材料为量子点或上转换纳米颗粒；所述酶标记为辣根过氧化物酶或蔗糖酶。上述的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种：（1）与所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上；（2）与所述核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；（3）所述核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。上述的核酸适配体，优选的，还包括所述核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体衍生物为由所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。上述的核酸适配体，优选的，还包括所述核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体衍生物为由所述核酸适配体改造而成的相应肽核酸。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了上述核酸适配体在制备用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的检测试剂盒中的应用。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的检测试剂盒，包括上述的核酸适配体。上述的核酸适配体，优选的，还包括结合缓冲液和洗涤缓冲液。优选的，所述结合缓冲液为bindingbuffer。所述洗涤缓冲液为PBS。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供了上述检测试剂盒在检测人高转移结肠癌细胞株LoVo中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：（1）本专利技术提供了一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体，通过Cell-SELEX筛选得到的核酸适配体与蛋白抗体相比具有更好的亲和力与特异性；免疫原性小；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且化学性质稳定，易于保存；便于标记等特点。（2）本专利技术提供了一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体的检测试剂盒，由于核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好，采用本专利技术的核酸适配体进行人高转移结肠癌LoVo细胞的检测时，操作更为简单、迅速。本专利技术的可识别人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体均可高亲和力的识别人高转移结肠癌细胞株LoVo，且结合能力强，解离常数均在纳摩尔范围以内。利用本专利技术的核酸适配体对其结合的靶分子进行钓取，可能得到其肿瘤标志物，这对于结肠癌的临床研究具有重要意义。附图说明为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1为本专利技术实施例1中利用Mfold软件模拟的核酸适配体FAM-J1的二级结构示意图。图2为本专利技术实施例1中利用Mfold软件模拟的核酸适配体FAM-J3的二级结构示意图。图3为本专利技术实施例1中利用Mfold软件模拟的核酸适配体FAM-J4的二级结构示意图。图4为本专利技术实施例1中利用Mfold软件模拟的核酸适配体FAM-J7的二级结构示意图。图5为本专利技术实施例1中流式细胞仪检测四条核酸适配体对人高转移结肠癌细胞株LoVo的结合能力的检测结果。图6为本专利技术实施例1中流式细胞仪检测四条核酸适配体对人非转移结肠癌细胞株SW480的结合能力的检测结果。图7为本专利技术实施例1中激光共聚焦扫描显微镜检测四条核酸适配体对人高转移结肠癌细胞株LoVo的结合能力及特异性的检测结果。图8为本专利技术实施例1中流式细胞仪测定核酸适配体FAM-J1结合LoVo细胞的解离常数绘制曲线。图9为本专利技术实施例1中流式细胞仪测定核酸适配体FAM-J3结合LoVo细胞的解离常数绘制曲线。图10为本专利技术实施例1中流式细胞仪测定核酸适配体FAM-J4结合LoVo细胞的解离常数绘制曲线。图11为本专利技术实施例1中流式细胞仪测定核酸适配体FAM-J7结合LoVo细胞的解离常数绘制曲线。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体为核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7中的一种；所述核酸适配体J1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA片段；所述核酸适配体J3的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的DNA片段；所述核酸适配体J4的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的DNA片段；所述核酸适配体J7的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示的DNA片段。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人高转移结肠癌细胞株LoVo的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体为核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7中的一种；所述核酸适配体J1的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的DNA片段；所述核酸适配体J3的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示的DNA片段；所述核酸适配体J4的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示的DNA片段；所述核酸适配体J7的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体还包括在核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述氨基化具体为在所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7核苷酸序列的5’端标记氨基基团-NH2。
4.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述巯基化具体为在所述核酸适配体J1、核酸适配体J3、核酸适配体J4、核酸适配体J7核苷酸序列的5’端标记巯基基团-SH。
5.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王柯敏，袁宝银，郭秋平，羊小海，何晓晓，蒋晓春，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43