本发明专利技术公开了一种含有编码Mnp蛋白基因的酵母表达载体，该载体中含有Mnp基因，结合乳酸酵母菌可胞外生产Mnp蛋白。本发明专利技术还公开了该含有编码Mnp蛋白基因的酵母表达载体的构建、制备Mnp蛋白和降解油菜秸秆木质素的方法。本发明专利技术利用了现代分子技术，将Mnp进行克隆，成功构建了表达载体。利用该载体并结合乳酸酵母菌GG799，可以进行Mnp的胞外分泌和表达，大大缩减了原始菌种的培养时间，提高Mnp的活性，且产生的Mnp可有效降解油菜秸秆的木质素。操作简单，便于香菇Mnp的商业化生产和应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于乳酸酵母细胞外分泌蛋白的表达载体基因工程研究
，具体涉及一种用于乳酸酵母(Kluyveromyces lactis GG799)细胞外分泌香燕猛过氧化物酶(Μηρ)蛋白的表达载体。本专利技术还涉及该表达载体的构建方法。
技术介绍
我国油菜种植面积大，油菜秸杆资源丰富。油菜秸杆中含有大量的纤维素(茎部达53%)、半纤维素(18.34%)等碳水化合物，是反刍动物的重要饲料来源(赵蒙蒙等，几种农作物稻杆的成分分析，材料导报，2011 (16):122-125)ο但生产中，油菜稻杆并没有被广泛的用于畜牧养殖业，大部分被直接焚烧(曹国良等，中国区域农田秸杆露天焚烧排放量的估算，科学通报，2007 (15):1826-183)或腐解还田，不仅浪费了资源，还严重污染环境。究其原因在于，油菜秸杆木质化程度高、秸杆粗硬、适口性差；油菜秸杆中木质素与纤维素形成坚固的酯键结构，抑制瘤胃微生物的降解，降低了瘤胃可消化性，若不加工处理，会影响动物米食量，降低生产性能(Ramirez-Bribiesca J E，Wang Y，Jin L，et al.Chemicalcharacterizat1n and in vitro fermentat1n of Brassica straw treated with theaerobic fungus， Trametes versicolor.Canadian Journal of Animal Science，2011，91(4):695-702)o以往多采用酸化、碱化等方式处理油菜秸杆，但其残留的酸碱，会对动物本身造成伤害，而且污染环境(张文杰等，秸杆处理方法的研究进展，中国畜牧兽医，2011(07):30-33)。与上述化学方法相比，利用微生物发酵技术处理油菜秸杆，则绿色、安全、无污染，且可提高饲料的适口性和利用率。白腐真菌是自然界中降解木质素最有效的微生物。用白腐真菌处理秸杆，能够显著的降低木质素含量，提高瘤胃利用率(Sharma R K，Arora D S.Product1n oflignocellulolytic enzymes and enhancement of in vitro digestibility duringsolid state fermentat1n of wheat straw by Phlebia floridensis.B1resourcetechnology, 2010， 101(23): 9248-9253 ；Arora D S， Gill P K.Product1n ofligninolytic enzymes by Phlebia floridensis.World Journal of Microb1logy andB1technology，2005，21(6-7): 1021-1028)。申请者在前期研究中发现，香菇菌(L.edodes)在发酵油菜秸杆过程中能够利用分泌的锰过氧化物酶(Μηρ)降解木质素，提高油菜秸杆的瘤胃有效降解率和体外有机物质消失率，但同时，发酵过程中产生的纤维素酶也会严重损耗油菜秸杆中的纤维素、半纤维素等瘤胃可利用物质，造成饲料能量的浪费(Zhaoet al.,Effect of fungal treatments of rape straw on chemical composit1n and invitro rumen fermentat1n characteristics.B1resources, 2015， 10(1): 622-637)。如何找到一种只降解木质素而不降解纤维素的方法，是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术利用现代分子技术成功构建了能够在酵母体外表达Μηρ蛋白(Lentinulaedodes mnp2 mRNA for manganese peroxidase, complete cds， GenBank: AB306943.1，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/AB306943.1)的表达载体 pKL-Mnp，利用该载体和乳酸酵母能够制备Μηρ蛋白，进而为Μηρ蛋白在生产中的应用提供技术支撑。本专利技术通过以下技术方案来实现上述
技术实现思路
: 一种含有编码香菇锰过氧化物酶(Μηρ)蛋白的酵母表达载体，其特征在于，该载体中含有Μηρ基因，结合乳酸酵母菌可胞外生产Μηρ蛋白。本专利技术还提供该含有编码Μηρ蛋白基因的酵母表达载体的构建方法，其步骤为: (1)将香燕菌在粉碎的油菜稻杆上固态发酵培养20d，固态发酵水分含量为70% ;固态发酵结束后提取香菇菌丝RNA，利用PCR技术体外扩增香菇Μηρ基因片段； (2)将Μηρ基因片段连接pMD19-T克隆载体，通过热击法导入大肠杆菌感受态细胞DH5a，转化大肠杆菌构建重组克隆载体pMD-Mnp ； (3)利用限制性内切酶XhoI和BamH I对重组克隆载体pMD_Mnp进行双酶切，胶回收Μηρ基因片段； (4)利用与步骤3中相同的限制性内切酶双酶切表达载体PKLAC2; (5)将步骤3中胶回收的Μηρ基因片段与步骤4中切后的pKLAC2载体连接，通过热击法导入大肠杆菌感受态细胞DH5 α，转化大肠杆菌构建重组表达载体pKL-Mnp，再利用质粒提取试剂盒从重组大肠杆菌中提取表达载体质粒pKL-Mnp。本专利技术还提供一种含有编码Μηρ蛋白基因的酵母表达载体制备Μηρ蛋白的方法，其步骤为， (1)提取上述重组表达载体pKL-Mnp，利用限制性内切酶SacII对pKL-Mnp载体进行线性化，反应体系为:lOXQuickCut buffer 5 KL，Sac II lKL，质粒8 KL，灭菌水36 ?，30°C孵育 5 min ； (2)将线性化的pKL-Mnp载体通过电穿孔仪转入商用酵母菌，条件:电压，2.5 kv ;时间，5 ms ;之后再置于含乙酰胺的YCB培养基中培养，筛选含Μηρ基因的重组酵母菌菌落； (3)将筛选出含Μηρ基因的重组酵母菌菌落加入到YPD液态培养基中，30°C震荡培养3-7 d，Mnp蛋白被分泌到培养液中，含Μηρ基因的重组酵母菌菌液12 h分泌到体外的锰过氧化物酶活性达到56.5 U/Lo作为优化，所述含乙酰胺的YCB培养基组成为，30 mmol/L Tris_HCl，l.17%酵母碳源基础，2%琼脂粉，5 mmol/L乙酰胺； 作为优化，所述YPD液态培养基组成为，1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。本专利技术还提供一种含有编码Μηρ蛋白基因的酵母表达载体降解木质素的方法，其步骤为， (1)取250ml锥形瓶，加入50~100 ml含2~4% (体积百分数)上述已整合Μηρ基因的重组酵母菌菌液的YPD培养基； (2)再向锥形瓶中加入0.5-1.0 g油菜稻杆； (3)30°C摇床中震荡培养3~7d，降解了 10~20% (重量百分数)的油菜秸杆木质素。利用重组DNA技术可将体外分离到的或合成的目的基因，通过与载体重组连接，导入不含该基因的受体细胞，使受体细胞产生目的基因蛋白。基于香菇菌在发酵油菜秸杆过程产生的Μηρ酶能够有效的降解木质素，本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有编码Mnp蛋白基因的酵母表达载体，其特征在于，该载体中含有Mnp基因，结合乳酸酵母菌可胞外生产Mnp蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵向辉，许兰娇，龚剑明，刘婵娟，瞿明仁，潘珂，宋小珍，欧阳克蕙，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西;36
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。