一种莱芜猪及其肉制品的鉴定方法技术

本发明专利技术属于畜牧及其肉制品品种鉴定技术，具体的说是一种莱芜猪及其肉制品的鉴定方法。利用本发明专利技术提供的引物序列，可以扩增待鉴定猪的D-loop区、Cytb基因和mtDNA全序。我们已经建立了全群纯种莱芜猪D-loop区和Cytb基因的序列库，目前纯种莱芜猪在NCBI的GENBANK数据库也有mtDNA全序。根据待鉴定猪与莱芜猪mtDNA核苷酸的差异原理，可以准确地判定待鉴定猪及其肉制品是否来自莱芜猪。本发明专利技术不仅可以鉴定猪品种或肉制品是否来自莱芜猪，如果不是还可以大致判定其品种来源。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于畜牧养殖技术，具体地说是。
技术介绍
莱芜猪是我国优良的地方品种猪之一，以较高的肌内脂肪含量（10%左右)而著称， 它是一个营养价值和经济价值都很高的猪品种。莱芜猪因品种独特而备受养殖者和消费者 的喜爱，导致市场上很多莱芜猪或其肉制品的假冒品。准确而高效的鉴定莱芜猪或其肉制 品成为一种急需的手段，不仅能够提供科学的鉴定方法，而且能够规范莱芜猪的种猪和肉 制品市场，进而维护养殖者和消费者的权益。猪品种鉴定的方法主要有外貌鉴定法和分子生物学技术法，外貌鉴定法需要特别 有经验的经纪人，主要靠看和摸等主观经验对猪种外表进行评定，有一定的主观性，鉴定方 法不科学。分子生物学技术鉴定猪的品种方法科学，结果可靠，但是需要找到适合本品种的 特异分子标记。 分子生物学鉴定猪的品种主要有三种方法：一是用母系遗传的mtDNA作为标记， 这也是最常用的方法，因为每个猪品种mtDNA的多态性丰富，基因片段较短。二是父系遗传 的Y染色体，这种方法使用较少，因为猪Y染色体上品种特异的标记位点很少。三是选择核 染色体上的微卫星标记，这种方法相对较可靠，但是要找到品种特异的微卫星标记需要的 时间长，耗费的成本高。到目前为止，用mtDNA作为分子标记鉴定品种是最常用的方法，但 是因其多态性丰富，所以要建立本品种mtDNA所有的多态位点库，关于莱芜猪品种及其肉 制品鉴定的研究甚少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： ，将待鉴定猪或其肉制品采样，用本方法提供的引 物进行扩增测序，通过序列比对可以鉴定该猪种是否是莱芜猪或其肉制品是否来自莱芜 猪。 待鉴定猪或其肉制品来自纯种猪，如果是杂交猪，该方法只能鉴定其母亲是否来 源于莱芜猪。 所述的待鉴定猪或其肉制品采样后提取总DNA，用本方法提供的引物首先进行 D-loop区和Cytb基因的扩增测序，与本方法提供的莱芜猪D-loop区和Cytb基因的全群基 因库进行比对。 所述的根据D-loop区和Cytb基因的比对结果初步判断待鉴定猪是否来自莱芜 猪，如果"不是"则立即下结论，如果"是"则要进一步用本方法提供的mtDNA全序引物进行 进一步的验证。 所述的用本方法提供的mtDNA全序引物获得待鉴定猪的mtDNA基因全序，再与 GENBANK基因库中的序列比对，验证待鉴定猪或其肉制品是否来自莱芜猪。 所述的用mtDNA全序引物能够准确判断该纯种猪或其肉制品是否来自莱芜猪，如 果不是来自莱芜猪，通过mtDNA全序比对可以大致判断其品种来源。 本专利技术所具有的优点： 只扩增D-loop区和Cytb基因进行测序，成本较低，本方法提供了莱芜猪D-loop区和Cytb基因的多态位点库，能够很快排除待鉴定猪及其肉产品不是来自莱芜猪。本方法提供 的D-loop区、Cytb基因以及mtDNA全序引物是猪的通用引物，只要是猪的样品都能扩增出 来。【附图说明】 图1待鉴定猪D-loop区和Cytb基因与莱芜猪基因库比对结果，可以判定该猪或 肉产品不是莱芜猪。该鉴定猪D-loop区（图A)和Cytb基因（图B)与莱芜猪基因库比对都 没有相同的序列。 图2待鉴定猪D-loop区和Cytb基因与莱芜猪基因库比对结果，可以初步判定该 猪或肉产品可能来自莱芜猪，需用mtDNA全序进一步验证。该鉴定猪D-loop区（A图)与莱 芜猪D-loop3序列相同，Cytb基因（B图）与莱芜猪Cytb2序列相同。 图3本专利技术提供的莱芜猪mtDNA全序与GENBANK数据库比对的结果图，可见莱芜 猪有特异的mtDNA标记位点。【具体实施方式】 下面的实施例中将本专利技术作进一步阐述，但本专利技术不限于此。 莱芜猪的肌内脂肪含量高，肉香而鲜美，导致市场上很多假冒的莱芜猪或其肉制 品。mtDNA有母系遗传的特点，并且多态性丰富，检测成本低，能够很好地应用于动物品种鉴 定中。 实施例 本实施例中莱芜猪及其肉制品鉴定的主要目的是判断待鉴定猪或其肉制品是否 来自莱芜猪，为养猪者或消费者提供科学的依据。本专利技术中的莱芜猪及其肉制品鉴定方法 包括下列步骤： 1)米样 采取待鉴定猪的耳组织、血液、带毛囊的毛根或者肉制品（最好是生肉）3-5g，如果不 能立即进行试验则应把样品浸泡在无水乙醇中，血液要加抗凝剂并4 °C保存。 2 )提取DNA进行PCR扩增测序 所取样品用酚仿抽提法提取总DNA，用本方法提供的D-loop区引物1，F: 5'-AGGAGACTAACTCCGCCAT-3'，R: 5'-CTGAGTCCAAGCATCCCCAA-3'，和引物2，F: 5'-CGCGCATATAAGCAGGTAAA-3' ，R: 5'-CGCGGATACTTGCATGTGT-3'；Cytb基因的引物F: 5'-GGAATTTAACCACGACCAATGAC-3'，R: 5'-GTGGCCCTCCTTTTCTGGTTTAC-3'；mtDNA全序引物 见表1。按照常规PCR体系进行扩增，退火温度58-64 °C，扩增后用PCR液进行测序。 表1扩增mtDNA全序的引物信息3)D-loop?α仲。γτο整囚斤少仰,、」金疋定w术曰米尤術 将获得的待鉴定猪的D-loop区和Cytb基因分别与本方法提供的莱芜猪序列库用DNAMAN软件进行序列比对，如果在提供的序列库中没有该类型的序列（见图1)，则可判定 待鉴定猪不是来自莱芜猪；如果在提供的序列库中有该类型的序列(见图2)，再用mtDNA全 序引物扩增待鉴定猪的mtDNA全序。 4)mtDNA全序鉴定是否来自莱芜猪 获得待鉴定猪的mtDNA全序后，在GENBANK数据库中比对，具体步骤为：NCBI-BLAST-nucleotideblast-待鉴定猪mtDNA全序-数据库选择Nucleotidecollection (nr/nt)-物种来源（Susscrofa(taxid:9823))-Optimizefor(Somewhatsimilar sequences(blastn))-FiltersandMasking不设任何参数，其他参数为默认值。根据序列 同源性大小则可判定待鉴定猪是否来自莱芜猪，也可大致判定其品种来源。比对结果见图 3〇【主权项】1. ，其特征在于：将待鉴定猪或其肉制品采样，用 本方法提供的引物进行扩增测序，通过序列比对可以鉴定该猪或其肉制品是否来自莱芜 猪。2. 按权利要求1所述的莱芜猪及其肉制品的鉴定方法，其特征在于：待鉴定猪或其肉 制品来自纯种猪，如果是杂交猪，该方法只能鉴定其母亲是否来源于莱芜猪。3. 按权利要求1或2所述的莱芜猪及其肉制品的鉴定方法，其特征在于：待鉴定猪或 其肉制品米样后提取总DNA，用本方法提供的引物首先进行D-loop区和Cytb基因的扩增测 序，与本方法提供的莱芜猪D-loop区和Cytb基因的全群基因库进行比对。4. 按权利要求3所述的莱芜猪及其肉制品的鉴定方法，其特征在于：根据D-loop区和 Cytb基因的比对结果初步判断待鉴定猪是否来自莱芜猪，如果"不是"则立即下结论，如果 "是"则要进一步用本方法提供的mtDNA全序引物进行进一步的验证。5. 按照权利4所述的莱芜猪及其肉制品的鉴定方法，其特征在于：用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种莱芜猪及其肉制品的鉴定方法，其特征在于：将待鉴定猪或其肉制品采样，用本方法提供的引物进行扩增测序，通过序列比对可以鉴定该猪或其肉制品是否来自莱芜猪。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于光辉，宋春阳，姜建阳，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37