一种西地那非及其结构类似物的免疫检测方法技术

本发明专利技术属于免疫检测技术领域，公开了一种西地那非及其结构类似物的免疫检测方法，即以巯基西地那非半抗原制备人工抗原，再制备得到抗体，并用于检测西地那非及其结构类似物，该方法克服了现有检测西地那非技术的缺陷和步骤，对西地那非的最大检测范围为0.024～1.21ng/mL，灵敏度为0.17ng/mL，检出限为0.008ng/mL，回收率为86.0～90.8%，该方法检测快速、大大缩短了检测时间，不考虑检测人员操作熟练程度的影响，整个检测过程仅仅需要80min左右即可完成，且检出限更低、灵敏度更高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫检测
，更具体地，涉及一种西地那非及其结构类似物的 免疫检测方法。
技术介绍
西地那非为roE-5抑制剂，用于治疗男性勃起功能障碍，属于处方药。然而，一些 保健食品生产企业为突出产品的功效，违法在保健食品中添加化学药物，如在抗疲劳产品 中非法添加枸橼酸西地那非、他达那非、瓦地那非等，对消费者身体健康构成严重威胁。 目前市场的补肾壮阳类、抗疲劳类保健食品违法添加了化学药品的现象可谓是触 目惊心。添加的成分主要为：西地那非、他达拉非、瓦地那非，其中以非法添加西地那非较 常见。2006年3月下旬查处的7种保健食品中有2种添加西地那非，5种添加了他达拉非； 2012年山西药监局公布的10种禁售保健食品中，7种含有TOE-5抑制剂，分别为西地那非， 他达那非；2013年1月上海公布的8种禁售的保健食品中，5种含有TOE-5抑制剂，分别为 西地那非、瓦地那非、他达那非、豪莫西地那非。与此同时，北京、江苏无锡、安徽铜陵、江苏 南通、南京、重庆、湖南衡阳等地的食品药品监督部门在当地的补肾、壮阳、抗疲劳保健食品 抽检中均检出西地那非等TOE-5抑制剂；不仅如此，还有一些尚未被批准的西地那非的结 构类似物被非法添加在保健食品、能量饮料、中草药中。 在不知情的情况下服用了添加西地那非及其结构类似物的保健食品极易引发毒 副作用，会出现头晕、昏晕、甚至青光眼，造成对肾功能、心脏功能、心血管疾病的严重损害。 长期服用，还会导致食用者勃起不倒，伤及阴部肌肉组织，甚至加重阳痿，甚至变为永久性 阳痿。国内已有内服枸橼酸西地那非后死亡的报道。因此对西地那非及其结构类似物建立 一种快速、有效的检测方法显得尤为重要。 西地那非及其结构类似物的检测最常使用的方法为仪器分析法，沈志武等（2008) 利用高效液相色谱法测定了保健食品中他达拉非、西地那非、伐地那非的含量；他达拉非和 西地那非的检出限为〇. 3 mg/L，伐地那非的检出限为0. 4 mg/L，回收率为95. 8~107. 0%。 国内进出口行业标准（SN/T 1951-2007)中已把HPLC-MS法作为进出口保健食品中西地那 非、他达那非、伐地那非的检测方法之一。该方法在片剂、胶囊剂中对三者的测定低限为1. 0 μ g/mg，回收率在83. 8~101%之间；口服溶液剂中对三者的的测定低限为0. 01 μ g/mL， 回收率在94. 5~108%之间。虽然上述几种仪器分析法的检测精确度高，但因其仪器化程 度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等，从而阻碍了其推广应用，因而通常作为实验 室确证方法，但是无法满足现场或者大批量的快速筛查检测。而免疫分析法因成本低、操作 简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，值得我们推广成为常用的筛选方法，现有 技术中缺乏一种抗体同时检测西地那非及其结构类药物的免疫方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题克服现有技术存在的上述问题，提供一种西地那非及其 结构类似物的免疫检测方法。 本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的： 式（I )所示结构的物质在检测西地那非及其结构类似物中的应用；所述西地那非的结 构类似物为瓦地那非、巯基西地那非、蒙莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、去甲西 地那非、异丙氧基硫代艾地那非、羟基豪莫西地那非、羟基巯基蒙莫西地那非、羟基硫代瓦 地那非、去乙基瓦地那非、乌地那非、巯基蒙莫西地那非、乌地那非、巯基蒙莫西地那非；所 述式（I)结构如下： 首先将巯基西地那非抗原包被于固相载体(化学发光酶标板）上，然后加入标准 品溶液或待测样品，再加入酶标记的巯基西地那非抗体，包被抗原与待测样品中的西地那 非及其结构类似物竞争酶标抗体，待测样品中西地那非及其结构类似物含量高时，则与固 相抗原结合的酶标抗体就少，反之结合在固相抗原上的酶标抗体就多，反应后加入发光液 加以测定，当酶标抗体量一定时，加入的待测样品含西地那非及其类似物越多，与固相抗原 结合酶标抗体就越少，发光反应减弱，百分发光值低，反之，则发光反应增强，百分发光值增 高，因而根据百分发光值与西地那非浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，并推算出 带刺样品中西地那非的浓度，其他与西地那非的结构类似物是根据它们对西地那非的交叉 反应率推算其实际浓度。专利技术人通过研究发现，利用巯基西地那非制备人工抗原免疫动物 后制备得到的抗体检测西地那非及其结构类似物时，效果更好。 本领域公知，酶联免疫检测方法的关键在于抗原和抗体的设计与选择，以及灵敏 度的高低，而灵敏度受检测过程中的每一个环节的制约，如何设计合适的抗原和抗体及其 制备方法，如何选择检测方法及协调每一步骤从而达到最优效果，是酶联免疫检测方法建 立的技术难题所在，本专利技术为了克服现有技术的缺陷，总结出一套优化的西地那非及其结 构类似物的直接化学发光酶联免疫检测方法。 本专利技术还提供式（I )所示结构的物质在制备检测西地那非及其结构类似物的制 剂中的应用；所述西地那非的结构类似物为瓦地那非、巯基西地那非、蒙莫西地那非、那莫 西地那非、硫代艾地那非、去甲西地那非、异丙氧基硫代艾地那非、羟基豪莫西地那非、羟基 巯基蒙莫西地那非、羟基硫代瓦地那非、去乙基瓦地那非、乌地那非、巯基蒙莫西地那非、乌 地那非、巯基蒙莫西地那非；所述式（I )结构如下：(I )。 本专利技术还提供上述半抗原的制备方法，是按质量比1 :0. 8~1. 2将巯基西地那非 及无水碳酸钾置于反应器中，用无水DMF溶解，然后加入与巯基西地那非摩尔比1 :1~1. 4 的溴乙酸甲酯反应30~40min后，终止反应，旋转蒸干DMF，用乙醚和蒸馏水（1: 1，v/v)溶 解残渣，萃取后即得。 具体的，所述萃取是：用乙醚和蒸馏水（1 :1，v/v)溶解残渣后，先乙醚萃取，水层 用浓NaOH调节pH，用二氯甲烷将沉淀溶解并萃取，二氯甲烷层蒸干，得到具有黏性白色结 晶物，取该白色结晶物，用THF/H20 (3 :2)溶解，加与该结晶物摩尔比1 :1~1. 4的LiOH， 45°C反应过夜，蒸干THF，用盐酸缓慢调节pH至4. 5,用乙酸乙酯反复萃取后将有机层蒸干 即得。 本专利技术还提供一种检测检测西地那非及其结构类似物的免疫检测方法，包括以下 步骤： 51. 将具有式（II)所示分子结构的巯基西地那非人工抗原作为免疫原免疫动物制备 巯基西地那非抗体，并与标记酶结合制备得到酶标抗体； 52. 将具有式(III)所示分子结构的巯基西地那非人工抗原作为包被原包被在微孔板 上；采用直接竞争化学发光酶联免疫法测定样品中西地那非及其结构类似物的含量。优选地，本专利技术所述免疫检测方法包括以下步骤： 51. 将具有式（II)所示分子结构的巯基西地那非人工抗原作为免疫原免疫动物制备 巯基西地那非多克隆抗体；采用过碘酸钠法与辣根过氧化物酶偶联制备辣根过氧化物酶标 记的巯基西地那非酶标抗体； 52. 将具有式(III)所示分子结构的巯基西地那非人工抗原作为包被原包被在酶标板 上； 53. 配制西地那非标准品溶液和化学发光液、浓缩洗涤液；采用直接竞争化学发光酶 联免疫法测定样品中西地那非类药物的含量。 所述包被有巯基西地那非人工抗原的化学发光酶标板是96孔或40孔可拆不本文档来自技高网...

【技术保护点】
式（Ⅰ）所示结构的物质在检测西地那非及其结构类似物中的应用；所述西地那非的结构类似物为瓦地那非、巯基西地那非、蒙莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、去甲西地那非、异丙氧基硫代艾地那非、羟基豪莫西地那非、羟基巯基蒙莫西地那非、羟基硫代瓦地那非、去乙基瓦地那非、乌地那非、巯基蒙莫西地那非；所述式（Ⅰ）结构如下：（Ⅰ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，邓丽华，朱彬，杨金易，李瑞婷，徐振林，王弘，雷红涛，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44