本发明专利技术提供了小麦TaAGO4a基因的CRISPR-Cas9载体及其应用，属于作物分子生物学领域。本发明专利技术首先提供了特异性靶向TaAGO4a第三个外显子的gRNA，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，包含一个酶切位点XmnI，本发明专利技术接着提供了含有该gRNA的CRISPR-Cas9载体，通过共转化Cas9和该特异性gRNA到小麦原生质体中，利用酶切和测序技术，成功检测到该gRNA可以引导Cas9切割分别位于TaAGO4a染色体3A、3B和3D上的三个拷贝，从而引起该基因发生移码突变，致使其功能缺失或部分缺失，可用于制备TaAGO4a基因缺失的转基因小麦。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及小麦TaAG04a基因的 CRISPR/Cas9载体及其应用。
技术介绍
小麦作为一种重要的粮食作物，全世界有35%-40%的以小麦为主要粮食。同时 作为三大谷物之一，产量几乎全做食用，是世界上总产量仅次于玉米的粮食作物。随着分 子生物学技术的不断发展和对基因功能研究的逐步深入，表观遗传学如DNA甲基化、组蛋 白修饰等在修饰基因、调控基因表达进而控制重要农艺性状如千粒重、开花等，发挥重要作 用。AG04a是AGO大家族成员，通过介导sRNAs参与DNA甲基化路径，进而调控相关基因的 表达。AG04蛋白作为RdDM路径的核心组分不仅参PAMP (pathogen-associated molecular pattern)启动的基础抗性，同时参与抗病基因介导的小种专化抗性。最新研究则显示，拟南 芥接种细菌后，包括AG04、AG06在内的10个RdDM路径组分的表达均下调，这种基因表达下 调直接导致了一个受甲基化调控的NLR(N0D-like rec印tor)类抗病基因 RMG1的上调，进 而启动抗病反应。说明包括AG04在内的整个RdDM路径在植物抗病反应中发挥重要作用。 在小麦中AG04a基因有三个拷贝，分别位于3A、3B和3D染色体上，分别命名为TaAG04a-A、 TaAG04a-B和TaAG04a-D。沉默该基因可以帮助研究人员进一步了解AG04a如何在小麦抗 病中的发挥作用，揭示其工作原理。 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/ Cas (CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，通 过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，包括噬菌体和外源质粒，致使目的基因功能 的缺失或部分缺失。CRISPR/Cas系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最 大的特点是操作简单、成本低、作用高效，是近两年来新发现并广泛用于基础研究的基因编 辑新技术。2013年，科学家首次报道CRISPR/Cas系统在细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、 果蝇、小鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas系统在靶位点产生双链DNA断裂（double strand break, DSB),细胞可通过非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ)进 行修复，导致基因发生移码突变，丧失功能。除此之外，该系统还能与同源重组载体、寡聚核 苷酸共同作用，使靶基因发生高效的精确修饰。CRISPR/Cas系统凭借其巨大优势迅速成为 基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能研究等领域得到广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小麦的CRISPR-Cas9载体及其在制备TaAG04a基因突变 的转基因小麦中的应用。 本专利技术首先根据TaAG04a_A、TaAG04a_B和TaAG04a_D的cDNA保守序列设计一个 长度为20bp的gRNA，该gRNA位于TaAG04a第三个外显子上，中间具有一个酶切位点，为 XmnI 〇 具体地，本专利技术提供的特异性靶向小麦TaAG04a基因第三外显子的gRNA的DNA序 列如SEQ ID NO. 1所示或如SEQ ID N0. 2所示。 本专利技术提供了上述gRNA在制备小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9载体中的应用。 本专利技术利用gRNA所构建小麦TaAG04a基因的CRISPR/Cas9载体，可以对TaAG04a 的三个拷贝，分别位于3A、3B和3D染色体上进行基因编辑，从而引起该基因发生移码突变， 致使功能部分或全部缺失。 进一步地，本专利技术提供了上述gRNA在制备TaAG04a基因突变的转基因小麦中的应 用。 含有本专利技术所述gRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9载体属于本专利技术的保护范围，其 能够特异地针对小麦TaAG04a基因。 进一步地，本专利技术的CRISPR/Cas9载体，其通过以下方法制备得到，将SEQ ID NO. 1、2所示的寡聚核苷酸在95°C，5min，从95°C开始降温，每分钟降低1°C，历时70min降 至25°C，在10°C下保持；U6-sgRNA骨架载体用限制性内切酶Bbsl进行酶切过夜，回收后， 与退火的寡聚核苷酸连接。 本专利技术提供了上述小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9载体在TaAG04a_A引起基因移 码突变的应用。 本专利技术提供了上述小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9载体在TaAG04a_B引起基因移 码突变的应用。 本专利技术提供了上述小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9载体在TaAG04a_D引起基因移 码突变的应用。 更进一步地，本专利技术提供了上述小麦TaAG04a基因 CRI SPR/Cas9载体在制备 TaAG04a基因突变的转基因小麦中的应用。 本专利技术提供了上述小麦TaAG04a基因 CRISPR/Cas9载体在制备抗病力提高的小麦 中的应用。 本专利技术还提供了用于检测CRISPR/Cas9_TaAG04a基因突变的引物组合，其核苷酸 序列如SEQ ID N0. 3-4所示。 本专利技术提供了核苷酸序列如SEQ ID NO. 3-4所示的引物组合在检测CRISPR/ Cas9_TaAG04a基因突变中的应用。 具体地，上述应用包括以下步骤： (1)提取待测小麦原生质体DNA，用XmnI酶切； (2)以酶切产物为模板，以SEQ ID N0. 3-4所示的核苷酸序列为引物进行PCR，PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测，若目的片段大小为956bp，回收PCR产物，用XmnI酶切回收产物， 此时没有被切的片段为阳性，发生切割的则没有突变产生，为阴性。 本专利技术通过构建TaAG04a基因的CRISPR/Cas9载体，实现部分沉默或同时沉默 TaAG04a基因，对研究该基因参与DNA甲基化路径的功能和对小麦抗病研究。进一步了解小 麦抗病中由RdDM介导的机理，对未来培育小麦抗病新品种有重要作用。【附图说明】 图1A-图1E为TaAG04a基因三个拷贝的同源序列比对图。*是指TaAG04a_A、 TaAG04a-B和TaAG04a-D三个拷贝间相同的序列。 图2为TaAG04a的gRNA连接到CRISPR/Cas9系统的载体上，通过测序验证正确连 接结果。虚框线是gRNA序列，通过多个样品测序说明gRNA已经正确连接。 图3为Xmn I酶切割PCR产物的琼脂糖凝胶图，1泳道为DNA marker ; 2泳道为 未转化CRISPR/Cas9-AG04a载体的野生型TaAG04a，为对照；3、4泳道为转化CRISPR/ Cas9-AG04a载体后，互为重复。2泳道中上面的亮度较弱的条带大小为956bp，下面的较亮 条带约为470bp和486bp(由于大小相差很小，电泳图中区分不是很明显）。3和4泳道分 别为被Cas9编辑过后，经过XmnI酶无法切割，表明该片段为阳性突变，3和4的条带分别为 956bp〇 图4A-图4C为CRISPR/Cas9_AG04a载体切割目的基因引起突变，经过测本文档来自技高网...
【技术保护点】
特异性靶向小麦TaAGO4a基因第三外显子的gRNA，其特征在于，分别位于染色体3A、3B、3C上，其DNA序列包含一个酶切位点XmnI。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李爱丽，宋高原，耿帅锋，贾美玲，毛龙，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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