本发明专利技术公开了一种小鼠精原干细胞特异性抗原4933427D06RIK及其抗体和应用。所述抗原4933427D06RIK由4933427d06rik基因（序列如SEQ ID NO.1所示）编码得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，并特异性表达于睾丸中精原干细胞表面。本发明专利技术所述4933427D06RIK蛋白特异性的表达于睾丸中精原干细胞表面，利用该蛋白制备出相应的抗体，可成功定位精原干细胞，进而可利用流式细胞术等方法高效分离出表达4933427D06RIK蛋白的SSCs细胞，从而实现SSCs细胞的识别、分离和纯化，为SSCs细胞的培养、诱导分化、移植等科研或临床应用提供支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞分离纯化
更具体地，设及小鼠精原干细胞特异性抗原 4933427D06RIK及其抗体和应用。
技术介绍
男性不育症的发生率为14%左右，是目前生殖医学面临的重要问题之一，精原干 细胞（Spermatogonialstemcells,SSCs)是雄性动物体内一类具有自我更新和分化产生 精子能力的细胞群；SSCs的研究发展为治疗男性不育提供了新的策略和方法。精原干细胞 是维持精子发生的基础，也是成体哺乳动物体内唯一一种被证明能够将遗传信息传递给下 一代的细胞。 成功识别、分离、纯化精原干细胞是进行细胞培养、诱导分化、移植等科研或临床 应用的前提。利用抗体通过流式细胞术可W高效分离出表达某种蛋白的细胞，而该方法的 关键与核屯、是蛋白的选择及其抗体的制备。 现有的研究显示，小鼠精原干细胞能够表达THYl、GFRal、CD9等细胞表面蛋白，细 胞表面分子是SSCs分选理想的标记物，但是，运些已知的分子并非在SSCs特异性表达；比 如，THYl是熟知的淋己细胞标记物，因此会严重影响SSCs的分离纯化效果。由于目前缺乏 对精原干细胞的特异性分子标记物的认识，无法对SSCs进行准确鉴别、分离和纯化。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种小鼠精原 干细胞特异性抗原4933427D06RIK，该蛋白特异性的表达于睾丸中的精原干细胞表面，利用 该蛋白制备出相应的抗体，可成功定位精原干细胞，进而可利用流式细胞术等方法高效分 离表达4933427D06RIK蛋白的SSCs细胞，从而实现SSCs细胞的识别、分离和纯化，为SSCs 细胞的培养、诱导分化、移植等科研或临床应用提供支持。 阳006] 本专利技术的目的是提供一种小鼠精原干细胞特异性抗原4933427D06RIK。 阳007] 本专利技术另一目的是提供利用所述抗原4933427D06RIK制备的精原干细胞特异性 识别抗体。 本专利技术的再一目的是提供所述小鼠精原干细胞特异性抗原4933427D06RIK及其 抗体在小鼠精原干细胞的特异性识别、分离、纯化中的应用。 本专利技术上述目的通过W下技术方案实现： 一种4933427d06rik基因，该基因特异性表达于小鼠睾丸中精原干细胞表面，该 基因的序列如SEQIDNO. 1所示。 一种小鼠精原干细胞特异性抗原4933427D06RIK，由上述4933427d06rik基因编 码得到，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示，并特异性表达于睾丸中精原干细胞表面。 所述4933427D06RIK特异性的表达于睾丸中精原干细胞表面，因此可作为精原干 细胞的标示物，应用于精原干细胞的识别、分离和/或纯化。 因此，所述抗原4933427D06RIK在作为精原干细胞的标示物中的应用，即所述抗 原4933427D06RIK在特异性识别、分离和/或纯化精原干细胞方面的应用，均在本专利技术的保 护范围之内。 另外，利用上述抗原4933427D06RIK制备得到的精原干细胞特异性识别抗体 4933427D06RIK，也在本专利技术的保护范围之内。 具体优选地，所述精原干细胞特异性识别抗体4933427D06RIK为多克隆抗体。 阳016] 作为一种可实施的优选方案，该抗体的制备方法包括如下步骤： SI.原核表达和纯化4933427D06RIK蛋白； S2.免疫家兔，获得含小鼠4933427D06RIK蛋白多克隆抗体的血清； S3.纯化血清，获得纯化的小鼠4933427D06RIK蛋白多克隆抗体。 更具体地，制备方法如下； SI.将4933427d06r化基因编码区克隆进PDEST17载体，转化化21感受态细菌； 待细菌生长至对数生长期前期，Wo.5mMIPTG诱导表达6X化S-4933427D06RIK融合蛋白， 37°C诱导4小时后离屯、收集菌体； S2. WPBS将菌体重悬，超声裂解化21细菌，离屯、取裂解液上清。通过儀柱纯化 6X化S-4933427D06RIK融合蛋白，W包含咪挫溶液洗脱蛋白；WSDS-PAGE确定蛋白浓度与 纯度；将纯度高于80%的蛋白用于下一步实验； W23] S3.纯化后的蛋白用于免疫家兔，多次免疫一个半月后，获得含小鼠 4933427D06RIK蛋白多克隆抗体的血清； S4.将 6X化S-4933427D06RIK融合蛋白共价偶联于AminoLinkPlusCoupling Resin; W等体积TBS稀释血清与抗原柱解育纯化血清，最后W抑2. 50. 2M甘氨酸洗脱得到 抗体。 阳0巧]得到的抗体立刻WIMTris-HClpH9. 0中和至P册.0 ;浓缩并添加等体积甘油 于-20°C保存。 另外，取上述获得的纯化后的6X化S-4933427D06RIK融合蛋白进行SDS-PAGE，转 印至NC膜；用S4中得到的纯化抗体进行解育，WIRDye680驴抗兔IgG化+L)抗体作为二 抗，用Odyssey双色红外激发光成像系统检测并记录。 本专利技术利用该抗体，通过流式细胞术等方法，可分离出表达4933427D06RIK蛋白 的精原干细胞（该阳性细胞类群高表达精原干细胞自我更新的标志基因，而低丰度表达精 原干细胞分化的标志基因）。[002引因此，所述精原干细胞特异性识别抗体4933427D06RIK在特异性的识别、分离和/ 或纯化精原干细胞方面的应用，也都在本专利技术的保护范围之内。 本专利技术具有W下有益效果： 本专利技术公开了一种小鼠精原干细胞特异性抗原4933427D06RIK及其抗体和应用。 所述抗原4933427D06RIK由4933427d0化化基因（序列如沈QIDNO. 1所示）编码得到， 其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示，并特异性表达于睾丸中精原干细胞表面。 本专利技术提供的4933427D06RIK蛋白特异性的表达于睾丸中精原干细胞表面，利用 该蛋白制备出相应的抗体，可成功定位精原干细胞，进而可利用流式细胞术等方法，可高效 分离表达4933427D06RIK蛋白的SSCs细胞，分离得到的SSCs细胞类群可W用于培养、扩增 等，从而实现SSCs细胞的识别、分离和纯化，为SSCs细胞的培养、诱导分化、移植等科研或 临床应用提供支持，进而SSCs的研究发展为治疗男性不育提供新的策略和方法。【附图说明】 图1为4933427d06rik基因（A)及其蛋白的表达情况；图中，A为4933427d06rik 基因在各个组织的表达情况，B为蛋白在各个组织的表达情况。 图2为4933427d06rik基因和Plzf基因的表达随小鼠日龄增长的变化趋势；图 中。 图3为4933427D06RIK蛋白、PLZF蛋白、GFRal蛋白、GATA4蛋白阳性细胞在曲细 精管上的定位；图中，A为4933427D06RIKW及化ZF蛋白、B为GFRal蛋白、C为GATA4蛋 白，D为其细胞重叠性统计。 图4为利用4933427D06RIK抗体进行流式细胞分选4933427D06RIK阳性细胞的结 果。 图5为4933427D06RIK阳性细胞类群的plzf，bcl化，etv5等精原干细胞自我更新 相关基因表达情况。 图6为4933427D06RIK阳性细胞类群的c-kit，SOh化1，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种4933427d06rik基因，其特征在于，该基因特异性表达于小鼠睾丸中精原干细胞表面，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄军就，松阳洲，林卓桁，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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