本发明专利技术涉及一种以黑果枸杞为原料制备矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷的方法。通过乙醇浸提，离心取上清液，真空浓缩，AB-8大孔树脂柱层析纯化，AKTA Purifier蛋白纯化系统与YMC-Pack ODS-A柱进一步分离纯化，冷冻干燥即为高纯度(97％以上)的矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷。采用体外清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基的方法分析矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷的抗氧化活性，发现其具有显著的抗氧化活性。本发明专利技术从黑果枸杞中提取矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷的方法具有提取效率高、重复性好、工艺温和等优点，制备的矮牵牛素-3-O-芸香糖(反式-香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷具有显著的抗氧化活性，因此在食品工业及医药行业具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及从茄科枸杞属黑果枸杞果实中提取相关成分的
，具体涉及一 种制备具有显著抗氧化活性矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷的 方法。
技术介绍
黑果枸杞为前科枸杞属多年生灌木，主要分布于我国陕西北部黄土高原、宁夏、甘 肃、青海、内蒙古、新疆和西藏等地区，中亚、高加索和欧洲等地区亦有分布。其中，我国新 疆、甘肃分布较多，且主要分布于新疆塔里木下游地区，属于典型的荒漠植物，而甘肃则主 要分布于河西走廊地区、黑河流域沿岸及其湿地地区。《维吾尔药志》记载，黑果枸杞果实具 有强肾、润肝、明目、健胃、补脑、抗衰老及通经作用。《晶珠本草》记载，黑果枸杞用于治疗心 热病、心脏病、月经不调、停经等且药效显著，民间作为滋补强壮、降压药用。黑果枸杞果实 里富含的花青素由于其卓越的保健养生功效，近年来也成为研究的热点。
技术实现思路
本专利技术旨在从黑果枸杞中高效、便捷地制备具有强抗氧化活性矮牵牛素-3-0-芸 香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷，实现本专利技术的具体方案如下： (1)取黑果枸杞干以1 : 40料液比用体积分数80%乙醇（含0· 1 %甲酸）在50°C 条件下水浴浸提3h; (2)将步骤（1)得到的黑果枸杞粗提液在4000rpm的离心机里离心3min;(3)将步骤（2)得到的离心上清液加入到旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度控制在45°C，旋 蒸至较浓稠的紫黑色液体； (4)将步骤（3)的旋蒸液加10mL上样于用AB-8大孔树脂填充的层析柱 (5X30cm)；(5)将步骤（4)所得带有颜色的收集液集中到旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度为40°C，旋 至较浓稠的紫黑色液体，用〇. 1%的TFA溶液稍加稀释； (6)将步骤（5)得到的旋蒸液过膜，向AKTAPurifier蛋白纯化系统进样lmL，通 过配制的流动相（4%甲醇、19%乙腈、1%甲酸的水溶液）和YMC-Pack0DS-A柱分离纯化样 品； (7)将步骤（6)所分离出的样品旋蒸，冷冻干燥即为高纯度的矮牵牛素-3-0-芸香 糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷； (8)将步骤（7)所得矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷用 去离子水分别配制成一系列浓度梯度的样品溶液，测定其对DPPH自由基和超氧阴离子自 由基的清除能力； 制备的矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷冷冻干燥后为 紫红色粉末，该花色苷对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率呈现剂量依赖关系，清 除DPPH自由基的IC5Q= 32. 5μg/mL，清除超氧阴离子自由基的1C5。= 106. 5μg/mL。【附图说明】 图1黑果枸杞花青素粗提物高效液相色谱（HPLC-DAD)分析图 图2矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷的高效液相色谱 (HPLC-DAD)分析图 图3矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷一级质谱（MS)分 析图 图4矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷二级质谱（MS)分 析图 图5矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0葡萄糖苷对DPPH自由基的 清除作用分析图 图6矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷对超氧阴离子自 由基的清除作用分析图【具体实施方式】 下面通过实施例，对本专利技术作进一步描述。 实施例1 : (1)取黑果枸杞干以1 : 40料液比用体积分数80%乙醇（含0· 1 %甲酸）50°C水 浴浸提3h; (2)将步骤（1)得到的黑果枸杞粗提液离心（4000rpm，3min); (3)将步骤⑵得到的离心液的上清液倒入旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度45°C，旋至较 浓稠的紫黑色液体； (4)将步骤（3)所得粗提物上样10mL于AB-8大孔树脂填充的层析柱（5X30cm); (5)将步骤（4)所得带有颜色的收集液集中到旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度为40°C，旋 至较浓稠的紫黑色液体，用〇. 1 %的TFA溶液稀释； (6)将步骤（5)所得的稀释液过膜，向AKTAPurifier蛋白纯化系统进样lmL，通 过配制的流动相（4%甲醇、19%乙腈、1%甲酸的水溶液）和YMC-Pack0DS-A柱分离纯化样 品； (7)将步骤（6)所得的样品旋蒸，冷冻干燥即为高纯度的矮牵牛素-3-0-芸香糖 (反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷； (8)将步骤（7)所得矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷 用去离子水分别配制成一系列浓度梯度（〇·〇1、〇· 02、0· 05、0· 10、0· 15、0· 20、0· 35、0· 50mg/ mL)的样品溶液，测定其对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力； 制备的矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷冷冻干燥后为 紫红色粉末，该花色苷对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率呈现剂量依赖关系，清 除DPPH自由基的IC5Q= 32. 5μg/mL，清除超氧阴离子自由基的1C5。= 106. 5μg/mL。 DPPH·清除率（％ ) = /A。X100 %A。组是以水代替样品溶液，A2组是以乙醇代替DPPH溶液，A3且是样品实验。 超氧阴离子自由基清除率（％ ) = [Ao-afAiVAoXlOO%A。组是以水代替样品，A2组是以磷酸盐缓冲液代替NBT溶液，A3且是样品实验。 实施例2 : 黑果枸杞中具有抗氧化活性的矮牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡 萄糖苷的结构分析与鉴定 (1)对黑果枸杞花青素粗提物进行高效液相色谱分析 ①色谱条件：TSKgel 0DS-80TSQA色谱柱 ②检测条件：波长：530nm、280nm、柱温：35°C、进样体积：20 μ L ③流动相及洗脱梯度： Α相：含15%甲醇的乙腈溶液Β相：1%甲酸、0. 1% TFA的水溶液 (2)对黑果枸杞花青素粗提物在AKTAPurifier蛋白纯化系统分离纯化分析①色谱条件：YMC-Pack0DS-A柱 ②检测条件：波长：280nm、进样体积：lmL、流速：2ml/min、每管收集5mL ③流动相配比：4%甲醇、19%乙腈、1%甲酸的水溶液 ④收集第9、10管的纯化物（紫红色） (3)对纯化产物高效液相色谱分析（条件同步骤1) (4)质谱分析 质谱条件：Agilent液相色谱-质谱联用仪（包括Agilent1100高效液相色谱仪 和AgilentG24450型质谱仪）；电喷雾电离源，正离子检测，扫描范围m/z0~1000,雾化 气体为氮气，流速为2L/min，电离电压为4. 5kV，锥孔电压为25V，离子源温度250°C。 结合一级质谱、二级质谱对样品分析，从图3、图4可分析出，样品分解过程为：MS/ MS:934/711/479/317,分析其基本构成为矮牵牛素花色苷，其5位连接一个葡萄糖苷键，其 3位连接一个芸香糖苷，芸香糖苷末端反式连接一个香豆酰基，最终鉴定该纯化产物为：矮 牵牛素-3-0-芸香糖（反式-香豆酰基）-5-0-葡萄糖苷。 综上所述仅为本专利技术的较佳施例而已，并非用来限定本专利技术的实施范围。即凡依 本专利技术申请专利范围的内容所做本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以黑果枸杞为原料制备矮牵牛素‑3‑O‑芸香糖(反式‑香豆酰基)‑5‑O‑葡萄糖苷的方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)取黑果枸杞干以1∶40料液比用体积分数80％乙醇(含0.1％甲酸)50℃水浴浸提3h；(2)将步骤(1)得到的黑果枸杞粗提液离心(4000rpm，3min)(3)将步骤(2)得到的离心液的上清液倒入旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度为45℃，旋至较浓稠的紫黑色液体。(4)将步骤(3)所得粗提物上样10mL于AB‑8大孔树脂填充的层析柱(5×30cm)；(5)将步骤(4)所得带有颜色的收集液集中到旋蒸瓶中旋蒸，旋蒸温度为40℃，旋至较浓稠的紫黑色液体，用0.1％浓度的TFA溶液稀释。(6)将步骤(5)所得稀释液过膜后向AKTA Purifier蛋白纯化系统进样1mL，通过配制流动相(4％甲醇、19％乙腈、1％甲酸的水溶液)和YMC‑Pack ODS‑A柱分离纯化样品；(7)将步骤(6)所得的样品旋蒸，冷冻干燥即为高纯度的矮牵牛素‑3‑O‑芸香糖(反式‑香豆酰基)‑5‑O‑葡萄糖苷。(8)将步骤(7)所得矮牵牛素‑3‑O‑芸香糖(反式‑香豆酰基)‑5‑O‑葡萄糖苷用去离子水配制一系列浓度梯度溶液，测定其对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力。制备的矮牵牛素‑3‑O‑芸香糖(反式‑香豆酰基)‑5‑O‑葡萄糖苷冷冻干燥后为紫红色粉末，该花色苷对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率呈现剂量依赖关系，清除DPPH自由基的IC50＝32.5μg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC50＝106.5μg/mL。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾晓雄，唐骥龙，闫亚美，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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