RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种RNAi干扰片段、RNAi干扰载体、及RNAi干扰载体的制备方法及其应用，涉及生物技术领域。其中，一种RNAi干扰片段，用于干扰绵羊Y染色体上的Zfy基因，其特征在于，所述RNAi干扰片段序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述Zfy基因负责编码的蛋白作为转录因子，与精子的发生有关。本发明专利技术RNAi干扰片段可以通过对雄性绵羊的生殖细胞Y精子中的Zfy基因进行沉默，阻碍、损伤或者破坏Y精子的正常发育和功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及生物
，具体设及一种RNAi干扰片段、RNAi干扰载体、及RNAi 干扰载体的制备方法及其应用。
技术介绍
在自然条件下，几乎所有哺乳动物的性别比例都接近1: 1，从而实现了无间断地进 行稳定地繁衍后代，在自然的条件下达到生态平衡。对于畜牧生产实际而言，理想的性别比 例具有十分重要的意义。利用泌乳、产蛋性状进行生产的生产企业希望得到更多的雌性个 体，而产肉、产毛性状的在雄性个体上表现得优势性更加明显。一直W来，人类对控制动物 后代的性别就有着极大的兴趣。目前性别控制主要从受精前和受精后两个方面进行，前者 应用精子分离后再进行受精，使得在受精时就决定了后代的性别；后者采用早期胚胎性别 鉴定，进行胚胎的性别筛选的方法来控制后代的性别。 哺乳动物性别决定理论认为，性染色体为"XX"的受精卵就能够发育成雌性个体， 而性染色体为"XY"的就会发育成雄性。那么从根本上讲，控制家畜性别最理想的方法是 先分离X、Y精子，然后再进行受精，就能人为地控制后代的性别，理论上运是在性别控制中 最简单、最经济的途径。自20世纪50年代后，关于精子分离的研究报告很多，运些研究都 试图利用X精子和Y精子不同的物理特性（体积、密度、电荷、运动性）），采用离屯、法、电泳 法、离子交换法、细胞表面抗原法等不同的方法来实现精子的分离，但是都有一个共同的问 题一一可重复性差。而且运些差异随着环境条件的不同而发生变化，因此，许多研究结果常 常不一致，甚至出现相反的结论，致使两类精子某些差异性研究存在争议。到目前为止，除 了Χ、Υ精子DNA含量具有差异可W肯定之外，其他方面的差异表现很小，甚至难W确定。但 是随着分子生物学技术的不断发展，W及研究工作的继续深入，新的研究成果将会不断涌 现。 目前根据哺乳动物X、Υ精子DNA含量存在差异的原理，利用流动细胞检索仪进行 分离X、Υ精子，分离效果最好，纯度可达90%W上，但是由于设备昂贵，分离速度慢，用于 受精的精子数量少、活力差等原因，远远不能满足生产上对性控精液的大量需求。相比之 下，如果能够找到两种精子发育或受精过程中，甚至胚胎发育时关键性的X、Υ染色体特异 mRNA，结合当代新兴的分子生物学技术利用RNA干扰（RNAInterference,RNAi)的方法则 有望W较低的成本，简便、快速地实现对动物的性别控制。 阳0化]RNAi是一种转录后的基因沉默（Post-transcriptionalGeneSilencing,PTG巧 现象，通过体外人工合成或体内产生的双链RNA(DiAble-strandedRNA.dsRNA)在细胞内特 异性地降解其同源的mRNA，使得相应的基因干扰，实现阻止目标基因的表达。RNAi方法能 够快速、简便、有效、特异地下调细胞中的基因表达，它不但是研究基因功能的一种有力工 具，而且也为特异性基因治疗提供了新的技术手段，其应用前景十分广阔。 在基因组、mRNA和蛋白水平的研究都证明，Χ、Υ精子基因表达的确存在差异。基因 表达检测研究表明，在精子形成的减数分裂粗线期，为防止一些酶类与性染色体发生作用， 两条性染色体高度浓缩形成性体。性体的形成保护了性染色体，性染色体上特殊基因的表 达被关闭。因此，哺乳动物成熟精子中没有mRNA的转录，然而哺乳动物成熟精子中却含有 mRNA，运种差异来自精子发生过程中的转录，其翻译远落后于转录。运些mRNA是精子成熟 后指导合成一些必须的蛋白，或者是受精后对卵母细胞mRNA库的补充，或作为RNAi对生育 和胎儿生长发育起着关键的作用。Hen化化sen等对小鼠的研究发现，减数分裂过程中，除Xist基因表达外，几乎所 有的性染色体基因都没有表达，然而减数分裂后期，一些性染色体特异基因开始表达。减数 分裂后，检测到Y染色体上化ely和S巧基因具有较高的mRNA水平；在X精子中也检测到 化elx基因mRNA高水平表达，同时发现X染色体特异基因Μ虹6A的表达产物。另外还有人 发现X、Υ染色体其他特异基因的表达，如X染色体特异基因Akap82 (精子尾部的骨架蛋白） 及Nap-X(编码一种核相关蛋白），Y染色体特异基因Zfy-1、Zfy-2及Y353/B。 其中Zfx/Zfy基因是染色体上编码锋指蛋白的一对等位基因，从减数分裂期开始 表达，在圆形精子细胞中的含量最高。Zfx基因是ZFY(zincfinger-Y)基因家族中的一 员，ZFY家族包括Zfx，Zfy和Z化基因，他们在分子结构上非常相似。一般哺乳动物有Zfx 和Zfy基因，Zfx基因位于X性染色体上，是雌、雄性哺乳动物X染色体必含的基因，Zfy 基因位于Y性染色体上，两个基因位于性染色体的末端，但并不位于同源区域。Zfx基因包 括一个酸性的转录激动区域，一个核定位序列和一个DNA连接区，具有13个C2肥型锋指结构。在哺乳动物细胞中，C2肥锋指结构是最常见的蛋白质结构之一。目 前已发现800多种具有运种锋指结构的蛋白质，具有重要的生理功能。Zfx/Zfy编码的蛋 白作为转录因子，在精子形成过程中具有一些功能并与精子的发生有关。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例提供一种RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及应用。主 要目的是通过RNAi干扰载体对动物Y染色体上的Zfy基因进行干扰，使得Zfy基因表达量 下降，W此达到人为控制动物性别的目的。 为达到上述目的，本专利技术主要提供如下技术方案： 一种RNAi干扰片段，用于干扰动物Y染色体上的Zfy基因，所述RNAi干扰片段序 列为沈QIDNO. 1或沈QIDNO. 2所示； 所述Zfy基因负责编码的蛋白作为转录因子，与精子的发生有关。 另一方面，上述的RNAi干扰片段作为制备干扰动物Y精子基因的药物的应用。 另一方面，一种RNAi干扰载体，用于干扰动物Y精子基因，其特征在于，所述RNAi 干扰载体克隆有RNAi干扰片段，所述RNAi干扰片段的序列为SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2 所示。 进一步的，所述RNAi干扰载体包括pLentiLox3. 7载体，所述pLentiLox3. 7载体 与所述RNAi干扰片段连接。 另一方面，所述RNAi干扰载体在在动物受精前进行性别控制中应用。 进一步的，所述RNAi干扰载体W睾丸直接注射的方式注射至动物体内，用于干扰 动物Y染色体上的Zfy基因。 一种RNAi干扰载体的制备方法，包括如下步骤： (1)酶切pLentiLox3. 7 载体； (2)将所述RNAi干扰片段与酶切后的所述pLentiLox3. 7载体连接，得到连接产 物； 其中，所述RNAi干扰片段序列为沈QIDNO. 1或沈QIDNO. 2所示； (3)将所述连接产物转化至感受态细胞中，筛选并将得到的菌液进行测序鉴定，并 将测序结果与所述RNAi干扰片段序列完全一致的菌液进行扩增； 所述酶切位点为化al和化oil;所述发夹结构序列为SEQIDNO. 3或SEQIDNO. 4 所示； (4)从所述扩增的菌液中提取RNAi干扰载体。 阳0巧]进一步的，所述的感受态细胞为pLentiLox3. 7载体细胞。 阳0%] 进一步的，所述筛选为W含有pLentiLox3. 7载体、酶切位点和发夹本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNAi干扰片段，用于干扰动物Y染色体上的Zfy基因，其特征在于，所述RNAi干扰片段序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述Zfy基因负责编码的蛋白作为转录因子，与精子的发生有关。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾斌，张永生，王绪海，申红，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65