利用小麦绿矮病植株为毒源建立的一种玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种利用小麦绿矮病植株为毒源建立的玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法。本发明专利技术的原理是于小麦拔节期田间采集表现小麦绿矮病典型症状的小麦植株，分子检测方法确定为小麦绿矮病植株，利用小麦绿矮病植株为毒源进行玉米品种对玉米粗缩病抗性接种鉴定。利用该方法评价玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平，既拓宽了品种抗性鉴定时间，又提高了灰飞虱的带毒率。这一鉴定方法可以应用于玉米品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及利用小麦绿矮病植株为毒源建立的一种玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法及其在农业上的应用，属于农业科学

技术介绍
：水稻黑条矮缩病毒(Riceblackstreakeddwarfvirus，RBSDV)属于呼肠孤病毒科斐济病毒属第二组成员，以灰飞虱为主要传毒媒介进行持久性传播，介体灰飞虱一旦染毒，终身带毒，并能连续传毒，但不经卵传毒。自然条件下，主要寄主有水稻、玉米、大麦、小麦、高粱、粟、看麦娘、稗草及狗尾巴草等禾本科植物，其中以玉米人工接种最为敏感。在我国，RBSDV侵染小麦引起小麦绿矮病，侵染玉米引起玉米粗缩病，侵染水稻引起水稻黑条矮缩病。小麦绿矮病植株的典型症状为植株矮缩、叶色浓绿，分蘖略有增多，心叶有缺刻；玉米粗缩病植株的典型症状为植株矮缩，叶色浓绿，叶片僵直、宽短而厚，叶背面出现蜡白色短条状突起，后期突起变褐色，籽粒较少或不结籽粒。上世纪60年代以来，玉米粗缩病在我国各玉米产区均有不同程度发生，多次暴发流行，对我国玉米生产构成严重威胁。选用抗病品种防治玉米粗缩病是最经济有效的措施。由于RBSDV等由昆虫作为媒介的特殊传播方式，不能使用病汁液摩擦进行直接接种。研究者主要采用田间自然传毒鉴定和人工接种鉴定进行玉米粗缩病的品种抗性鉴定。田间鉴定易受环境条件、灰飞虱种群发生及迁飞数量等因素的影响，鉴定的准确性较差，使选育抗病品种往往需多年多地重复鉴定，极大延缓了抗玉米粗缩病育种进程。人工接种鉴定提高了玉米粗缩病品种抗性鉴定的准确性，目前成熟的方法是通过在玉米病株上饲喂获得携带RBSDV的灰飞虱进行病毒接种，这就需等当年玉米发病后才能开展鉴定工作，极大限制了研究时间，此外灰飞虱不能在玉米上繁殖，以玉米病株为毒源会影响灰飞虱的带毒率。利用小麦绿矮病植株为毒源开展玉米粗缩病的品种抗性接种鉴定工作，提高了灰飞虱带毒率，延长了接种时间，从而拓宽了玉米品种抗性鉴定时间，以期为玉米品种的抗性评价、抗玉米粗缩病品种的选育等提供切实可行的鉴定技术，加快抗玉米粗缩病的育种进程。
技术实现思路
：本专利技术提供了利用小麦绿矮病植株为毒源建立的一种玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法。本专利技术的原理是：小麦拔节期，田间采集表现小麦绿矮病典型症状的小麦植株，分子检测方法确定为小麦绿矮病植株，利用小麦绿矮病植株为毒源进行玉米品种对玉米粗缩病抗性接种鉴定。在上述方法中，小麦绿矮病典型症状是指植株矮缩、叶色浓绿，分蘖略有增多，心叶有缺刻。本专利技术提供了一种利用小麦绿矮病植株为毒源的玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法，利用该方法评价玉米品种对玉米粗缩病的抗性水平，既拓宽了品种抗性鉴定时间，又提高了灰飞虱的带毒率。这一鉴定方法可以应用于玉米品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。附图说明：图1小麦绿矮病植株与健康小麦植株示意图图2疑似小麦绿矮病植株RT-PCR检测结果(M：MarkerIII；1-17：疑似小麦绿矮病植株；CK+：阳性对照；CK-：阴性对照)图3小麦绿矮病植株为毒源饲喂灰飞虱示意图图4携带RBSDV的灰飞虱接种玉米幼苗示意图图5玉米粗缩病植株为毒源饲喂灰飞虱示意图图6利用不同毒源饲喂灰飞虱所得灰飞虱带毒率(A：小麦绿矮病植株为毒源；B：玉米粗缩病植株为毒源)具体实施方式：下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1，利用小麦绿矮植株为毒源建立的玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法(1)携带RBSDV新鲜小麦植株的获得2013年4月于江苏建湖重病区采集植株矮缩、叶色浓绿，分蘖略有增多，心叶有缺刻等表现出小麦绿矮病典型症状的新鲜小麦植株(图1)。参照Trizol(Reagent)说明书提取小麦叶片的总RNA。采用已发表引物RB1-S9-F：5′-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3′(R：A/G；Y：T/C；M：A/C)和RB-S9-R：5′-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3′(H：T/G；M：G/A/T)(引物由上海生工生物技术公司合成)进行RT-PCR检测，确定小麦疑似病株是否携带RBSDV。以提取的2μL小麦叶片总RNA为模板、RB-S9-R为引物，参照M-MuLV反转录酶(Fermentas)说明书进行反转录，合成cDNA。以合成的2μLcDNA为模板、RB1-S9-F/RB-S9-R为引物进行PCR反应，使用常规PCR反应体系，最终体系由ddH2O补足25μL。PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后取2μLPCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的条带(1200bp)(图2)。同时采用斑点免疫结合法(Dot-ELISA)确定病株不携带水稻条纹病毒(RSV)。挑选出3株仅含有RBSDV的小麦植株饲毒。(2)小麦绿矮病植株为毒源饲喂灰飞虱本室常年饲养无毒灰飞虱群体，为避免传毒介体污染，每次使用无毒灰飞虱若虫前取100头Dot-ELISA法检测其是否携带RSV，确定其为无毒虫。将筛选得到的新鲜小麦病株种于1000mL烧杯中，土面覆盖滤纸，将适量1-2龄无毒灰飞虱若虫移入其中，并用纱布封口(图3)，饲喂48h后将其移入预先育有武育粳3号健康秧苗的1000mL烧杯中过循回期(10-12d)，循回期过后取100头灰飞虱Dot-ELISA法检测其RBSDV带毒率。(3)玉米粗缩病品种抗性鉴定将感病玉米品种苏951播于塑料杯中，每杯播种5株苗，待玉米苗长至2叶龄时进行接种鉴定(接种前2d淘汰病弱苗，挑选生长一致的幼苗4株用于接种鉴定)，重复3次，每个重复20株(图4)。根据(2)中测定的灰飞虱带毒率换算有效接种虫量(有效接种虫量＝接种虫量×带毒率)，本实验中有效接种虫量为3头/株。接入灰飞虱后每天赶虫2次以确保被测水稻均匀获毒，接种48h后移走灰飞虱，4叶时将玉米移栽至室外，正常水肥管理。30d后开始病害调查，每2天调查一次，连续调查3次。玉米粗缩病植株症状主要表现为植株矮化，叶色浓绿，叶片僵直、宽短而厚，心叶不能正常展开，叶片背部叶脉上产生蜡白色隆起条纹，用手触摸有明显粗糙感。实施例2，分别以小麦绿矮病植株和玉米粗缩病植株为毒源的比较研究(1)灰飞虱带毒率的比较参照实施例1中(2)，分别利用小麦绿矮病植株与玉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用小麦绿矮病植株为毒源的玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法，其特征在于：于小麦拔节期田间采集表现出植株矮缩、叶色浓绿，分蘖略有增多，心叶有缺刻典型症状的小麦植株，以利用分子检测方法确定为小麦绿矮病的植株为毒源进行玉米品种对玉米粗缩病的抗性接种鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种利用小麦绿矮病植株为毒源的玉米粗缩病品种抗性接种鉴定方法，其特
征在于：于小麦拔节期田间采集表现出植株矮缩、叶色浓绿，分蘖略有增...

【专利技术属性】
技术研发人员：周彤，杜琳琳，周益军，吕建颖，曹晓燕，兰莹，孙枫，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32