用于高效率且高通量产生转基因事件的改进的分割种子大豆转化制造技术

公开了一种用于土壤杆菌介导的大豆胚系转化的方法，包括用含有转基因的根癌土壤杆菌感染具有一部分胚轴的分割的(split)大豆种子。所述方法可以进一步包括在选择培养基上从转化的包含部分胚轴的切割大豆种子体外再生外植体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2012年12月19日提交的美国临时申请61/739,349的优先权，兹将其全文援引并入本申请。对电子提交的序列表的援引序列表的正式拷贝作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web电子提交，文件名为“73502_ST25.txt”，2013年12月10日生成，大小为19,301字节，并与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中包含的序列表是说明书的一部分，兹将其全部援引并入本申请。
本公开涉及一般意义上的植物育种。提供了用于大豆转化的方法。本公开的方法可用于转基因大豆的高效率并且高通量的生产，和转基因大豆产品的产业开发。背景大豆(Glycinemax)是最重要的农业作物之一，全世界每年的作物产量超过2亿公吨，估计价值超过400亿美元。大豆占全球油料种子生产的超过97％。因此，提高这种有价值的作物的质量和产量的可靠而高效的方法具有显著的利益。用于改良大豆的传统育种方法已经受到限制，因为大部分的大豆栽培种仅源于少数几个亲本系，导致种质育种基础较窄。Christou等，TIBTECH8:145-151(1990)。现时的研究工作主要致力于在用植物基因工程技术来提高大豆产量。转基因方法旨在将期望的基因导入到作物植物的可遗传种系中，以产生优良的植物品系。这种策略已经成功地增加了其它几种作物植物对疾病、昆虫和除草剂的抗性，同时提高了营养价值。已经开发出了多种用于将基因转移到植物组织中的方法，包括高速微喷射、显微注射、电穿孔和直接DNA摄取。最近，土壤杆菌介导的基因转化已经被用于将感兴趣的基因导入到大豆中。然而已经证明，大豆对转基因工程而言是一个具有挑战性的系统。大豆外植体的高效转化和再生是难以实现的，并且经常难以重复。根癌土壤杆菌是一种致病性的土栖细菌，具有将其DNA(称为T-DNA)转移到宿主植物细胞内、并诱导宿主细胞产生可用于细菌营养的代谢物的固有能力。使用重组技术，可以将一些或全部的T-DNA用感兴趣的基因取代，产生可用于转化宿主植物的细菌载体。土壤杆菌介导的基因转移通常针对组织培养物中未分化的细胞，但也可以针对从植物叶片或茎获取的已分化细胞。已经开发了多种用于大豆的土壤杆菌介导的转化方法，它们可以根据被转化的外植体组织松散地分类。美国专利No.7,696,408，Olhoft等人公开了一种子叶节(cotyledonarynode)方法，用于转化单子叶植物和双子叶植物。“子叶节”方法涉及从5-7日龄大豆幼苗通过在子叶节的正下方切割除去下胚轴，切开并分离剩余的带有子叶的下胚轴节段，并从子叶除去上胚轴(epicotyl)。将子叶外植体在腋芽和/或子叶节的区域中造伤口(wounded)，并与根癌土壤杆菌在黑暗中培养五天。该方法需要在体外萌发种子，并且制造伤口步骤(woundingstep)会引入显著的变数。美国专利No.6,384,301，Martinelli等人公开了向来自从大豆种子切下的大豆胚的活分生组织中进行土壤杆菌介导的基因传递，随后用选择剂和激素培养分生外植体，并诱导芽形成。与“子叶节”方法相似，优选地在感染之前对分生外植体致伤。美国专利No.7,473,822，Paz等人公开了一种改良的子叶节方法，称作“半种子外植体”法。使成熟的大豆种子吸胀，表面灭菌，并沿着种脐切开。在感染之前，胚轴和芽被完全除去，但没有其它的伤口出现。进行土壤杆菌介导的转化，选择潜在转化体，并在选择培养基上再生外植体。使用这些方法的转化效率仍然相对较低，“子叶节”法在0.3％-2.8％的量级，“分生外植体”法为1.2-4.7％，“半种子外植体”法为3.2％-8.7％(整体4.9％)。本领域的典型转化效率为大约3％。改良的“分割种子”转基因程序可以加速未来转基因大豆产品的生产和开发。用于将转基因稳定整合到大豆组织中的高效且高通量的方法将促进育种进程，并具有提高作物的产量的潜力。公开概要本公开涉及转化植物细胞的方法。更具体地，本公开涉及用于转化大豆(Glycinemax)的方法，其使用土壤杆菌介导转化分割的(split)大豆种子，其中分割的大豆种子保留一部分胚轴。在一个实施方案中，本公开涉及一种产生转基因事件的方法，包括将切割工具插入大豆种子的种皮以产生第一子叶节段和第二子叶节段，用土壤杆菌接种包括部分胚轴的该第一子叶节段，所述土壤杆菌包括至少一个转基因，并培养经接种的子叶节段以在经转化的植物细胞中产生转基因事件。在另一个实施方案中，本公开涉及一种产生转基因事件的方法，该方法包括将切割工具插入大豆种子的种皮以产生包含部分胚轴的子叶节段，用土壤杆菌接种包含该部分胚轴的子叶节段，所述土壤杆菌包含至少一个转基因，并培养经接种的子叶节段以在经转化的植物细胞中产生转基因事件，并从该经培养的接种子叶节段产生完整、能育的植物，该完整、能育的植物包含所述转基因事件。附图简述图1是大豆种子的俯视图。图2是图1的大豆种子的侧视图。图3是图1的大豆种子的沿3-3线截取的剖视图。图4是与图3相似的视图，显示切割工具与大豆种子的部分胚轴的交会。图5是图1的大豆种子的沿5-5线截取的剖视图。显示切割工具顺着大豆的纵轴插入大豆中。图6是一对子叶节段的俯视图。图7显示了pDAB9381的质粒图，依照具体的实施方案，该构建体可用于土壤杆菌介导的大豆外植体的转化。图8显示了pDAB107533的质粒图。图9显示了描绘在不同比例的草甘膦下有至少一半子叶变黄的外植体的百分比的图。图10显示了pDAB105958的质粒图。序列表附随的序列表中列举的核酸序列是使用如37C.F.R.§1.822定义的核苷酸碱基的标准字母缩写显示的。仅显示了每个核酸序列的一条链，但是应当理解的是，任何对所显示的链的提述包括了互补链。在附随的序列表中：SEQIDNO:1显示了用于本公开的质粒构建体pDAB9381中的YFP植物转录单元(PTU)。SEQIDNO:2显示了用于本公开的质粒构建体pDAB9381中的PAT植物转录单元(PTU)。SEQIDNO:3显示了用于本公开的质粒构建体pDAB107553中的DGT-28植物转录单元(PTU)。SEQIDNO:4显示了用于本公开的质粒构建体pDAB107553中的PAT植物转录单元(PTU)。SEQIDNO:5显示了用于本公开的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生转基因事件的方法，该方法包括：将切割工具插入大豆种子的种皮以形成第一子叶节段和第二子叶节段，其中所述种子包含胚轴；用土壤杆菌接种包含部分所述胚轴的第一子叶节段，所述土壤杆菌包含至少一个转基因；并培养经接种的子叶节段以在经转化的植物细胞中产生转基因事件。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.19 US 61/739,3491.一种产生转基因事件的方法，该方法包括：
将切割工具插入大豆种子的种皮以形成第一子叶节段和第二子叶节段，
其中所述种子包含胚轴；
用土壤杆菌接种包含部分所述胚轴的第一子叶节段，所述土壤杆菌包含
至少一个转基因；并
培养经接种的子叶节段以在经转化的植物细胞中产生转基因事件。
2.权利要求1的方法，其中该方法还包括在接种所述第一子叶节段之前
从所述第一子叶节段和第二子叶节段除去种皮。
3.权利要求1的方法，其中插入切割工具包括纵向切割胚轴以保留部分
胚轴与每个子叶节段在一起。
4.权利要求3的方法，其中在插入切割工具之前大豆种子工具的胚轴有
一未切割长度，且所述第一子叶节段的部分胚轴的长度是该大豆种子的胚轴
的未切割长度的大约1/3至1/2。
5.权利要求4的方法，还包括切割所述第一子叶节段的部分胚轴至该大
豆种子的胚轴的未切割长度的约1/3至1/2的长度。
6.权利要求3的方法，其中在插入切割工具之前该大豆种子的胚轴有一
未切割长度，且所述第一子叶节段的部分胚轴的长度与该未切割长度相等。
7.权利要求1的方法，其中插入切割工具包括沿着该大豆种子的种脐纵
向切割该大豆种子。
8.权利要求7的方法，还包括定位该大豆种子的外表面上的种脐，并在
插入切割工具之前将切割工具相对于该大豆种子定向，使得切割工具与该种
脐对齐。
9.权利要求8的方法，其中每个子叶节段包含部分种脐。
10.权利要求7的方法，其中该大豆种子具有延伸穿过所述种脐的纵
轴，该纵轴将该大豆种子分为第一侧和第二侧，该方法还包括在插入切割工
具之前握住该大豆种子的第一侧。
11.权利要求1的方法，其中插入切割工具包括在形成所述第一和第
二子叶节段之前将切割工具推进到该大豆种子的胚轴内。
12.权利要求1的方法，其中该方法还包括从经培养的经接种的子叶

\t节段产生完整、能育的大豆植物，其中该完整、能育的大豆植物包含所述转
基因事件。
13.通过权利要求12的方法产生的完整、能育的大豆植物，其中该...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·帕雷迪，S·R·切纳雷迪，T·明尼克斯，O·卡尔波娃，D·格里芬，P·S·贾亚库马尔，K·史密斯，R·萨里亚米兰，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国;US