本发明专利技术公开了一种甜瓜离体再生的方法。本发明专利技术所提供的一种甜瓜离体再生的方法包括下述步骤：①以甜瓜子叶为外植体，将外植体接种于芽诱导培养基进行培养，获得不定芽丛；②将步骤①获得的不定芽丛置于芽伸长培养基甲进行培养，获得不定芽；③将步骤②获得的不定芽置于生根培养基进行培养，获得甜瓜再生苗。本发明专利技术提供的甜瓜离体再生的方法，具有不定芽诱导率高，玻璃化程度低，再生周期短等优势，将该方法应用在甜瓜遗传转化中，可获得较高的转化率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及生物
，具体设及一种甜瓜离体再生的方法及其在甜瓜遗传转 化中的应用。
技术介绍
[000引甜瓜（CucumismeloL.)是一种重要的水果型蔬菜作物，属于葫芦科 (化curbitaceae)，黄瓜属（化cumis)，甜瓜种。甜瓜在国内外栽培普遍，近年来，随着甜瓜生 产的规模化发展，甜瓜病虫害发生日益严重，造成甜瓜产量锐减、品质下降。 利用转基因技术手段进行种质定向改良是培育高产优质的甜瓜新品种的有效途 径。开展甜瓜转基因技术研究，对于甜瓜病虫害防治及品种改良均具有重要的意义。与其 它作物相比，甜瓜转基因技术研究进展相对缓慢，目前将外源基因导入甜瓜的方法主要有 农杆菌介导法、花粉管通道法、显微注射法和基因枪法等，其中农杆菌介导的转化法相对比 较成熟，且费用低、基因沉默现象少，是目前双子叶植物遗传转化的主要方法。建立一个高 效、稳定的再生系统，是植物遗传转化成功的前提条件。器官分化途径是甜瓜进行外源基因 遗传转化时的一个主要途径，通过器官分化出不定芽建立再生系统周期短，避免了体细胞 变异。目前，通过器官分化途径进行甜瓜遗传转化的研究已有不少成功的报道，但在子叶离 体再生过程中，也存在由愈伤组织分化出芽困难，直接分化不定芽分化率较低，且再生体 系重复性差等问题，因此，建立高效、稳定的再生体系仍然是研究的重点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是建立高效、稳定的甜瓜再生体系。 为解决上述问题，本专利技术首先提供了一种甜瓜离体再生的方法。 本专利技术提供的甜瓜离体再生的方法包括下述步骤： ①W甜瓜子叶为外植体，将外植体接种于芽诱导培养基进行培养，获得不定芽 丛；[000引所述芽诱导培养基可为含有1. Omg/L~2. Omg/L(例如1. Omg/L~2. Omg/L或1. Omg/L或2. Omg/L)的6-BA的MS固体培养基； ②将步骤①获得的不定芽丛置于芽伸长培养基甲进行培养，获得不定芽； 所述芽伸长培养基甲可为含有0.1 mg/L~0. 2mg/L的6-BA和0. 03mg/L~0. 07mg/ L(例如0. 03mg/L~0. 05mg/L或0. 05mg/L~0. 07mg/L或0. 03mg/L或0. 05mg/L或0. 07mg/ L)的IAA的MS固体培养基； ③将步骤②获得的不定芽置于生根培养基甲进行培养，获得甜瓜再生苗； 所述生根培养基甲可为含有0. 05mg/L~0. 15mg/L(例如0. 05mg/L~0.1 mg/L或 0.1 mg/L~0. 15mg/L或0. 05mg/L~0. 15mg/L或0.1 mg/L或0. 15mg/L或0. 05mg/L)的IBA 和2g/L~4g/L(例如2g/L~3g/L或3g/L~4g/L或2g/L或3g/L或4g/L或2g/L~4g/ L)的活性炭的MS固体培养基。[001引所述芽诱导培养基具体可为含有1.Omg/L的6-BA的MS固体培养基。 所述芽伸长培养基甲具体可为含有0.Img/L的6-BA和0. 05mg/L的IAA的MS固 体培养基。[001引所述生根培养基甲具体可为含有0.Img/L的IBA和3g/L的活性炭的MS固体培养 基。 上述甜瓜离体再生的方法中，所述步骤①中所述外植体的制备方法为：将甜瓜种 子播种于MS固体培养基，培养后获取甜瓜种子的子叶部分。所述外植体的制备方法中，所 述培养的条件可为：26°C~30°C、暗培养3~5天。所述培养的条件具体可为：28°C、暗培 养3天。所述甜瓜种子具体可为消毒后的甜瓜种子。所述甜瓜种子的消毒步骤可为：甜瓜 种子剥去种皮，用70% (体积比）乙醇水溶液浸泡20~30s，用无菌水洗2~3次，然后将 甜瓜种子用1% (质量体积比）次氯酸钢水溶液消毒lOmin，无菌水洗涂4~5次后，用无 菌滤纸吸干多余水分，获得消毒后的甜瓜种子。 上述甜瓜离体再生的方法中，所述步骤①中所述培养的条件可为：25°C~28°C， 培养28天~35天。所述培养可为光暗交替培养（即光培养和暗培养交替）。所述光暗交 替培养中，光照培养时的光照强度为1500LX~2500LX。所述步骤①中所述培养的条件具 体可为：26°C，培养28天。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度具体可为2000LX。 所述光暗交替培养的周期具体可为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。 上述甜瓜离体再生的方法中，所述步骤②中所述培养的条件可为：25°C~28°C， 光照培养14~28天。所述培养可为光暗交替培养（即光培养和暗培养交替）。所述光暗 交替培养中，光照培养时的光照强度为1500LX~2500LX。所述步骤②中所述培养的条件具 体可为：26°C，培养21天。所述光暗交替培养中，光照培养时的光照强度具体可为2000LX。 所述光暗交替培养的周期具体可为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。 上述甜瓜离体再生的方法中，所述步骤③中所述培养的条件可为：25°C~28°C。 所述培养可为光暗交替培养（即光培养和暗培养交替）。所述光暗交替培养中，光照培养时 的光照强度为1500LX~2500LX。所述步骤③中所述培养的条件具体可为：26°C。所述光 暗交替培养中，光照培养时的光照强度具体可为2000LX。所述光暗交替培养的周期具体可 为：16小时光照培养/8小时黑暗培养。 上述任一所述甜瓜离体再生的方法在甜瓜遗传转化中的应用也属于本专利技术的保 护范围。 本专利技术还提供了一种甜瓜遗传转化方法，包括如下步骤： (1)将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；[002引 似取步骤（1)得到的重组农杆菌，对甜瓜子叶外植体进行侵染； (3)完成步骤（2)后，取所述甜瓜子叶外植体，置于共培养培养基，进行共培养；iM~llOuM或 90]iM~100yM 或100yM~110yM或90yM或100yM或110yM)的乙酷下香酬的MS固体培养基； (4)完成步骤（3)后，取所述甜瓜子叶外植体，依次置于初步筛选培养基和再次筛 选培养基进行培养，获得抗性芽甲； 所述初步筛选培养基可为含有0. 5~1. 5mg/L(例如0. 5~1. 5mg/L或0. 5mg/L或 Img/L或 1. 5mg/L或 0. 5 ~Img/L或 1 ~1. 5mg/L)的 6-BA、40 ~60mg/L(例如 40mg/L~ 60mg/L或 40mg/L或 50mg/L或 60mg/L)的Kan和 90 ~llOmg/L(例如 90mg/L~llOmg/L 或90mg/L或llOmg/L或lOOmg/L)的Tim的MS固体培养基； 所述再次筛选培养基可为含有0. 5~1. 5mg/L(例如0. 5~1. 5mg/L或0. 5mg/L或 Img/L或 1. 5mg/L)的 6-BA、60 ~80mg/L(例如 60mg/L~80mg/L或 60mg/L或 70mg/L或 80mg/L)的Kan和 90 ~llOmg/L(例如 90mg/L~llOmg/L或 90mg/L或llOmg/L或lOOmg/ L)的Tim的MS固体培养基；[002引 妨完成步骤（4)后，取所述抗性芽甲，置于芽伸长培养基乙进行培养，获得抗性 芽乙； 所述芽伸长本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甜瓜离体再生的方法，包括下述步骤：①以甜瓜子叶为外植体，将外植体接种于芽诱导培养基进行培养，获得不定芽丛；所述芽诱导培养基为含有1.0mg/L～2.0mg/L的6‑BA的MS固体培养基；②将步骤①获得的不定芽丛置于芽伸长培养基甲进行培养，获得不定芽；所述芽伸长培养基甲为含有0.1mg/L～0.2mg/L的6‑BA和0.03mg/L～0.07mg/L的IAA的MS固体培养基；③将步骤②获得的不定芽置于生根培养基甲进行培养，获得甜瓜再生苗；所述生根培养基甲为含有0.05mg/L～0.15mg/L的IBA和2g/L～4g/L的活性炭MS固体培养基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许勇，张春秋，张海英，宫国义，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。