本发明专利技术为一种依据遗传背景的微营养素矫正人基因组损伤的方法，属于营养基因组学和医学遗传学应用技术领域；本方法采集个体外周血，检测血液叶酸、血清VB12和Hcy水平，抽提核DNA，结合MTHFR C677T和A1298C基因型和个体的基因组损伤状况，依据各种血液微营养素维护基因组稳定的参考值(红细胞叶酸高于700nM、血清叶酸高于34nM、血清VB12高于300pM，以及血清Hcy低于8μM)，对基因组高损伤个体给予微营养素干预建议，以矫正个体的遗传损伤，进而维护基因组稳定性；本策略有利于预防心血管疾病，降低基因组损伤相关疾病危险度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是，属于营养基因 组学和医学遗传学应用
，其目标是通过微营养素矫正基因组损伤，在部分个体达 到降低环境-遗传相关疾病、退行性疾病危险度的目标。
技术介绍
微营养素主要为矿物质和维生素，是人体需要量较少，但不可或缺的物质，一些微 营养素作为遗传物质代谢、损伤修复和表观修饰等重要反应的底物或辅助因子，在防止基 因组损伤中起到重要作用。 叶酸（folate)作为一类重要的微营养物质，参与生物体一碳单位的代谢。人体不 能合成叶酸，需从外界摄入。由于叶酸设及DNA合成和甲基化两个重要的生物化学过程， 对维护染色体正常结构和基因表达具有重要的作用。叶酸一方面参与尿喀晚脱氧核巧酸 (加T巧到胸腺喀晚脱氧核巧酸（dTT巧的合成，另一方面通过同型半脫氨酸化cy)合成甲 硫氨酸（Met)、S-腺巧甲硫氨酸（SAM)的生化过程进而影响DNA甲基化。叶酸缺乏可导致 dTTP合成受阻，加TP积累并渗入DNA，在继后的DNA复制和修复过程中诱发基因突变、DNA 单双链断裂、染色体的断裂等基因组稳定性下降事件；叶酸缺乏也可导致SAM合成受阻、 Hey累积，从而降低基因组甲基化程度，改变细胞中的特异性甲基化模式，从而改变基因表 达方式，DNA甲基化水平的降低还可能导致着丝粒异染色质凝聚水平下降，从而在有丝分裂 过程中引起染色体异常分离，诱发非整倍体。 在叶酸代谢途径中，亚甲基四氨叶酸还原酶（methylenetetr址y化ofolate re化ctase，MTHFR)是一碳代谢中的核屯、酶，它不可逆地催化5,10-亚甲基四氨叶酸巧， l〇-methyleneTHF)向5-甲基四氨叶酸巧-methylTHF)转化，而5-methylTHF在维生素 B12(VB。）依赖的甲硫氨酸合成酶（M巧的催化下，将甲基转移给化y，合成Met;SAM随即为 DM甲基化提供甲基。因此，MTHFR的催化作用对叶酸在DM甲基化或DM合成之间的分支 走向发挥着关键作用。编码MTHFR的基因MTHFR在人群中存在若干多态形式，可能构成影响 叶酸代谢结局的遗传因素。MTHFR存在的多态性常见为：MTHFR677CT和1298AC，677CT 和677TT个体MTHFR酶活分别为野生型（CC)个体的65%和30%;而MTHFR1298AC和1298 CC个体MTHFR酶活与1298AA个体相比也有显著降低，运些突变会使得胞内Hey积累，降低 活性甲基化合物合成减少，基因组DNA甲基化程度降低，从而增加基因组不稳定性。VB12作 为甲基供体合成途径中关键酶MS的辅酶，直接影响MS酶活。VB12缺乏也可提高血清化y 水平，DM甲基供体合成效率和基因组甲基化程度下降，增加基因组不稳定性；VB12缺乏还 导致5-methylTHF的利用率下降，抑制5, 10-methyleneTHF提供甲基合成dTMP的反应， 使得胞内加MP积累，并错误渗入DNA，造成基因组稳定性下降系列事件。 因此，叶酸和VB12缺乏、W及Hey水平上升所引起的一系列基因组损伤事件，与遗 传-环境相关疾病、发育异常和退行性疾病（如老年性痴呆、帕金森氏病、高血压、屯、血管疾 病、糖尿病、骨质疏松症、肿瘤等）的危险度增加密切相关。据此，个体叶酸及其代谢相关的 物质、VB12摄入和代谢状况可作为基因组健康诊疗的依据。结合个体的遗传背景，通过个 性化微营养干预，矫正由于叶酸缺乏和代谢异常及不良环境因素造成的基因组损伤，降低 相关疾病的患病风险。目前临床生化检验也对血清叶酸、VB12、Hey水平进行分析，运些检测均服务于疾 病诊断和治疗，其所依据的临床标准与本技术W矫正基因组损伤、预防相关疾病为宗旨的 标准不同。 目前关于叶酸和VB12的应用大多集中在治疗贫血和预防出生缺陷上，根据遗传 背景及营养状况，将叶酸-VB12合理摄入应用于Hey降低、基因组稳定性维护和基因组损伤 矫正，预防基因组损伤引发的疾病，未见有类似的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，将 叶酸及其代谢相关组分VB12合理摄入应用于维护基因组稳定性和矫正基因组损伤，创建 依据MTHFRC677T和A1298C的营养干预策略，并结合个体血液微营养素水平，矫正个体遗 传损伤。 -种依据遗传背景的微营养素矫正人基因组损伤的方法，包括如下步骤： (1)血液叶酸水平检测：S1.血清获得：用促凝管采集个体外周血，然后放于4°C凝血比，不要超过比， 250化pm离屯、15-20min，黄色的上清为血清，分装为每个300y1，放于-20°C避光保存；[001引 S2.血清叶酸水平检测：血清样本放室溫解冻半小时后，将样本加入邸CKMAN Access2全自动免疫分析仪进行检测，得到受检样本血清叶酸值；S3.红细胞获得：邸TA-抗凝管采集个体外周血，100化pm离屯、5-lOmin分离红细 胞，用生理盐水洗S次红细胞，100化pm离屯、5min，将红细胞按1:21的比例稀释于质量浓度 为0. 2%的抗坏血酸溶液中，使细胞破碎，-20°C避光保存；S4.红细胞叶酸检测：将破碎的红细胞样本放室溫解冻半小时后，将样本加入 BECKMANAccess2全自动免疫分析仪进行检测，得到受检样本红细胞叶酸值；[001引似血清VB12和Hc:y水平检测：S1.血清获得：用促凝管采集个体外周血，然后放于4°C凝血比，不要超过比， 250化pm离屯、15-20min，黄色的上清为血清，分装为一个300y1，放于-20°C保存；S2.血清VB12水平检测：血清样本放室溫解冻半小时后，将样本加入邸CKMAN Access2全自动免疫分析仪进行检测，得到检测样本血清VB12值；S3.血清VB12水平检测：血清样本放室溫解冻半小时后，将样本加入生化分析仪 HITACHI7600,检测样本血清H巧值； (3)MTHFR基因型分析： S1.DNA提取：[002。 取外周全血200y1用北京天根公司DNA抽提试剂盒进行DNA抽提； S2.PCR扩增 25y1 体系： 677 引物序列：677F5 ' -TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3 ' 677R5 ' -AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3 '677位点反应体系：基因组DNA0. 2yg/yL:4yL 677 引物 50yM:lX2" 2XPCR混合酶：12. 5y1无菌 3DW:6. 5y1 总计：25yl;677位点的PCR程序：阶段 1 :95°C预变性 5min阶段 2 :95°C变性 30sec，6rC退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 40 次 阶段3 :72°C终止延伸7min，最后4°C保存 1298 引物序列：1298F5 ' -ATGTGGGGGGAGGAGCTGAC-3 ' 1298R日'-GTCTCCCAACTTACCCTTCTCCC-3 ' 1298位点反应体系：基因组DNA0. 2yg/yL:4yL 1298 引物 50yM:1X2 " 2XPCR混合酶：12. 5y1无菌 3DW:6. 5yl总计：25]il;[004引1298位点的PCR程序：阶段 1 :95°C预变性 8min阶段 2 :95°C变性Imin，63. 5°C退本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种依据遗传背景的微营养素矫正人基因组损伤的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)血液叶酸水平检测：S1.血清获得：用促凝管采集个体外周血，然后放于4℃凝血1h，2500rpm离心15‑20min，黄色的上清为血清，分装为每个300μl，放于‑20℃避光保存；S2.血清叶酸水平检测：血清样本放室温解冻半小时后，将样本加入BECKMAN Access2全自动免疫分析仪进行检测，得到受检样本血清叶酸值；S3.红细胞获得：EDTA‑抗凝管采集个体外周血，1000rpm离心5‑10min分离红细胞，用生理盐水洗三次红细胞，1000rpm离心5min，将红细胞按1:21的比例稀释于质量浓度为0.2％的抗坏血酸溶液中，使细胞破碎，‑20℃避光保存；S4.红细胞叶酸检测：将破碎的红细胞样本放室温解冻半小时后，将样本加入BECKMAN Access2全自动免疫分析仪进行检测，得到受检样本红细胞叶酸值；(2)血清VB12和Hcy水平检测：S1.血清获得：用促凝管采集个体外周血，然后放于4℃凝血1h，2500rpm离心15‑20min，黄色的上清为血清，分装为一个300μl，放于‑20℃保存；S2.血清VB12水平检测：血清样本放室温解冻半小时后，将样本加入BECKMAN Access2全自动免疫分析仪进行检测，得到检测样本血清VB12值；S3.血清VB12水平检测：血清样本放室温解冻半小时后，将样本加入生化分析仪HITACHI 7600，检测样本血清Hcy值；(3)MTHFR基因型分析：S1.DNA提取：取外周全血200μl用北京天根公司DNA抽提试剂盒进行DNA抽提；S2.PCR扩增25μl体系：677引物序列：677F 5ˊ‑TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA‑3ˊ677R 5ˊ‑AGGACGGTGCGGTGAGAGTG‑3ˊ确定677位点反应体系，进行677位点的PCR程序；1298引物序列：1298F 5ˊ‑ATGTGGGGGGAGGAGCTGAC‑3ˊ1298R 5ˊ‑GTCTCCCAACTTACCCTTCTCCC‑3ˊ确定1298位点反应体系，进行1298位点的PCR程序；PCR结束后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果：含677位点的扩增片断为198bp，含1298位点的扩增片断为241bp，剩余产物于‑20℃冷冻保存；S3.限制性酶切：A、Hinf Ⅰ酶切677PCR产物依次加入10×Buffer 2μl，10μl PCR产物，1μl Hinf Ⅰ 10U限制性内切酶，灭菌双蒸水补至终体积为20μl，37℃水浴1h以上70℃灭活15min，3％琼脂糖凝胶电泳检测：CC型为单一198bp，CT型为198和175bp，TT型为单一175bp；B、Mbo Ⅱ酶切1298PCR产物依次加入10×Buffer 2μl，10μl PCR产物，1μl Mbo Ⅱ 10U限制性内切酶，灭菌双蒸水至终体积为20μl，37℃水浴1h后70℃灭活15min，3％琼脂糖凝胶电泳检测：AA型为单一204bp，AC型为241和204bp，CC型为单一241bp；S4.琼脂糖凝胶电泳及检测确定个体基因型：A、制胶：称取3％琼脂糖，溶于0.5×TBE中，微波炉加热，充分溶解后，按比例加入核酸染料，摇匀，倒入制胶槽，室温放置，待其凝固；B、琼脂糖凝胶电泳：加入10μl酶切产物点样，电压为100V，时间50‑60min；C、紫外检测：紫外分析仪检测电泳结果，根据检测结果确定PCR结果及两个位点的基因型；(4)评价与营养干预：红细胞叶酸高于700nM、血清叶酸高于34nM、血清VB12高于300pM，以及血清Hcy低于8μM是各种微营养素及代谢产物维护基因组稳定的参考值，对比参考值，结合个体MTHFR两个位点的基因型和基因组损伤状况，判断相关微营养素的是否缺乏，给予一定的营养干预策略，MTFHR两位点突变的个体应适当提高叶酸和VB12的摄入剂量，干预4‑6个月后，复检各生化指标及个体的基因组损伤，判断微营养素干预对不同个体基因组损伤的矫正效果。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汪旭，倪娟，梁子卿，薛京伦，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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