一种毛细管电泳快速检测碱基不匹配数量的方法技术

本发明专利技术涉及生物分析技术领域，一种毛细管电泳快速检测碱基不匹配数量的方法，步骤如下：(1)设计3’端偶联荧光染料的DNA，形成荧光探针；(2)设计若干与步骤(1)所述DNA片段具有不同数量不匹配碱基的互补DNA；(3)分别将若干互补DNA与荧光探针在毛细管内杂交，经荧光检测，计算峰面积比(S1/STotal)，得到峰面积比与不匹配碱基数的标准曲线，待测样品与荧光探针毛细管内杂交后，计算其电泳峰面积比，对照标准曲线确定待测样品的不匹配碱基数。本发明专利技术提供的毛细管内快速检测不匹配碱基数的方法，操作简单，可重复性高，能方便快捷的检测出样品中不匹配碱基数量，进一步拓展了DNA荧光探针在生物分析领域的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物分析
，具体涉及。
技术介绍
检测碱基序列的方法有桑格法、待测序法、单分子测序等，但是检测一般都需要较大型的检测仪器，检测费用也较高。荧光染料是一种可吸收紫外线或可见光并将其由短波长转化为较长波长的可见光并反射出来，可用肉眼看见其反射出来的明亮色彩。荧光染料由于其灵敏度高，操作方便，逐渐取代了放射性同位素作为检测标记，其广泛应用于荧光探针，细胞染色，特异性DNA染色等。另一方面，毛细管电泳作为一种快速有效、高灵敏、低样品消耗的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。同时，通过将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管的应用。且毛细管内的方法相对毛细管外的方法更灵敏、更迅速、样品消耗更低。本方法通过DNAl-FAM荧光探针与互补DNA在毛细管内杂交的电泳峰变化，绘制标准曲线，来快速检测互补DNA中的不匹配碱基数目。
技术实现思路
本专利技术克服现有技术中检测互补DNA中不匹配碱基数目的不足，提供，拓宽其在生物分析领域中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为，，步骤如下:(I)设计3’端偶联荧光染料的DNA，形成荧光探针；(2)设计若干与步骤⑴所述DNA片段具有不同数量不匹配碱基的互补DNA ;(3)分别将若干互补DNA与荧光探针在毛细管内杂交，经荧光检测，计算峰面积比(Si/SuJ，得到峰面积比与不匹配碱基数的标准曲线，待测样品与荧光探针毛细管内杂交后，计算其电泳峰面积比(S1Z^cital)，对照标准曲线确定待测样品的不匹配碱基数。进一步地，所述的荧光染料为6-FAM。进一步地，所述互补DNA与荧光探针在毛细管内的进样顺序为先进电泳迀移速度慢的荧光探针，再进电泳迀移速度快的互补DNA，所述互补DNA与荧光探针进样时间差保证两者能在毛细管内杂交。作为优选，所述荧光探针中DNA为5’ -GGT TGG TGT GGT TGG-3’。作为优选，所述的毛细管采用内径75 μ m，全长60cm，有效长度35cm的石英毛细管，通过18kV的高压电源使待测样品及缓冲液在毛细管内流动。采用上述的技术方案后，本专利技术所取得的有益效果是，本专利技术提供的毛细管内快速检测不匹配碱基数的方法，操作简单，可重复性高，能方便快捷的检测出样品中不匹配碱基数量，进一步拓展了 DNA荧光探针在生物分析领域的应用。【附图说明】图1:DNA1-FAM与含有不同数量不匹配碱基的互补DNA在毛细管内杂交的电泳图。(a，DNAl-FAM ;b，互补链为 5’-CCA ACC ACA CCA ACC-3’；c，互补链为 5’-CCA ACC ACACCA ACG-3> ;d，互补链为 5’ -CCA ACC ACA CCA AGG-3> ;e，互补链为 5’ -CCA ACC ACA CCGGGG-3，;f，互补链为 5’ -CCA ACC ACA GGG GGG-3，)图2 =S1Z^cital与不匹配碱基数量的关系。【具体实施方式】本专利技术将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本专利技术实施的限制。实施例11、毛细管米用内径75 μπι，全长60cm，有效长度35cm的石英毛细管，通过18kV的高压电源使待测样品及缓冲液在毛细管内流动。2、(I)设计DNAl-FAM荧光探针，该探针包括荧光染料6-FAM和DNAl两部分。DNAl为5’-GGT TGG TGT GGT TGG-3’，3’端偶联荧光染料；(2)设计五种互补DNA，分别为5’_CCAACC ACA CCA ACC-3’(零个不匹配碱基)，5’ -CCA ACC ACA CCA ACG-3> ( 一个不匹配碱基)，5’ -CCA ACC ACA CCA AGG-3> (两个不匹配碱基)，5’ -CCA ACC ACA CCG GGG-3，(四个不匹配碱基)，5’ -CCA ACC ACA GGG GGG-3，(六个不匹配碱基);(3) DNAl-FAM与含有不同数量(O个，I个，2个，4个，6个)不匹配碱基的互补DNA按相同的浓度比2: 2，在毛细管内间隔20s，分别进样20s，荧光毛细管电泳检测(图1)。发现随着不匹配碱基数的增大，复合物(荧光探针与互补DNA杂交)的电泳峰逐渐减小，DNAl-FAM电泳峰逐渐增大，S1ZSlotal逐渐增大，得到标准曲线(图2)。 3、将待检测DNA2，序列为5’ -CCA ACC ACA CCA AGC-3’，进行毛细管电泳，得到S1/sTcital为0.1，与标准曲线对照，检测其不匹配数量为I。实施例21-2步骤同实施例1。3、将待检测DNA3，序列为5’ -CCA AGG ACA CCA ACC-3’，进行毛细管电泳，得到S1/Slotal^ 0.2，与标准曲线对照，检测其不匹配数量为2。以上述依据本专利技术的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项专利技术技术思想的范围内，进行多样的变更及修改。本项专利技术的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术范围。【主权项】1.，其特征在于:(1)设计3’端偶联荧光染料的DNA，形成荧光探针； (2)设计若干与步骤⑴所述DNA片段具有不同数量不匹配碱基的互补DNA; (3)分别将若干互补DNA与荧光探针在毛细管内杂交，经荧光检测，计算峰面积比(S1/Slotal)(其中，S1为荧光探针峰面积，S Tcital为所有峰面积)，得到峰面积比与不匹配碱基数的标准曲线，待测样品与荧光探针毛细管内杂交后，计算其电泳峰面积比(Si/SuJ，对照标准曲线确定待测样品的不匹配碱基数。2.根据权利要求1所述的毛细管电泳快速检测碱基不匹配数量的方法，其特征在于:所述的荧光染料为6-FAM。3.根据权利要求1所述的毛细管电泳快速检测碱基不匹配数量的方法，其特征在于:所述互补DNA与荧光探针在毛细管内的进样顺序为先进电泳迀移速度慢的荧光探针，再进电泳迀移速度快的互补DNA，所述互补DNA与荧光探针进样时间差保证两者能在毛细管内杂交。4.根据权利要求1所述的毛细管电泳快速检测碱基不匹配数量的方法，其特征在于:所述荧光探针中 DNA 为 5’ -GGT TGG TGT GGT TGG-3’。5.根据权利要求1所述的毛细管电泳快速检测碱基不匹配数量的方法，其特征在于:所述的毛细管采用内径75 μ m，全长60cm，有效长度35cm的石英毛细管，通过18kV的高压电源使待测样品及缓冲液在毛细管内流动。【专利摘要】本专利技术涉及生物分析
，，步骤如下：(1)设计3’端偶联荧光染料的DNA，形成荧光探针；(2)设计若干与步骤(1)所述DNA片段具有不同数量不匹配碱基的互补DNA；(3)分别将若干互补DNA与荧光探针在毛细管内杂交，经荧光检测，计算峰面积比(S1/STotal)，得到峰面积比与不匹配碱基数的标准曲线，待测样品与荧光探针毛细管内杂交后，计算其电泳峰面积比，对照标准曲线确定待测样品的不匹配碱基数。本专利技术提供的毛细管内快速检测不匹配碱基数的方法，操作简单，可重复性高，能方便快捷的检测出样品中不匹配碱基数量，进一步拓展了DNA荧光探针在生物分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毛细管电泳快速检测碱基不匹配数量的方法，其特征在于：(1)设计3’端偶联荧光染料的DNA，形成荧光探针；(2)设计若干与步骤(1)所述DNA片段具有不同数量不匹配碱基的互补DNA；(3)分别将若干互补DNA与荧光探针在毛细管内杂交，经荧光检测，计算峰面积比(S1/STotal)(其中，S1为荧光探针峰面积，STotal为所有峰面积)，得到峰面积比与不匹配碱基数的标准曲线，待测样品与荧光探针毛细管内杂交后，计算其电泳峰面积比(S1/STotal)，对照标准曲线确定待测样品的不匹配碱基数。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王建浩，秦玉琴，滕一万，陈瑶，李进晨，蒋鹏举，邱琳，王车礼，杨丽，张晨澄，樊杰，柳丽，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32