从金花茶叶中提取多糖的方法技术

本发明专利技术提供了从金花茶叶中提取多糖的方法，包括以下步骤：1)将金花茶叶加水提取，得到水提液；2)将水提液浓缩后，加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，再加入蛋白酶酶解，得到酶解液；4)将酶解液置于频率为1000～5000kHz超声波下处理15～60s，然后经截留分子量为14000的透析袋透析，取保留液经截留分子量为450000的透析袋透析，取透过液浓缩，再加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。本发明专利技术得到的金花茶多糖具有较好的免疫活性。

【技术实现步骤摘要】
从金花茶叶中提取多糖的方法
本专利技术属于生物提取
，具体涉及从金花茶叶中提取多糖的方法。
技术介绍
金花茶(Camelliachrysantha(Hu)Tuyama)属山茶科山茶属金花茶组植物，被誉为“茶族皇后”和“植物界大熊猫”。金花茶叶作为广西壮族民间传统的一种中草药，具有降血糖、降血脂、抑制肿瘤生长、提高机体免疫能力等多种生理功能，其中，金花茶多糖被认为是重要的功效成分之一。《金花茶多糖抗小鼠免疫性肝损伤作用的研究》(发表于华西药学杂志，2014,9(5)：525～527)公开了金花茶多糖的提取方法为：将干燥的金花茶叶粗粉1kg加入10L石油醚回流脱脂提取2次，每次提取1.5h,挥尽药渣中的石油醚后，沸水提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至150ml，用氯仿-正丁醇(3:1)多次萃取，得到除去蛋白质的上清液，加95％乙醇沉淀过夜，抽滤，弃去上清液，滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮洗涤，即得金花茶粗多糖。经DE52型树脂层析柱洗脱，真空干燥得粉末状金花茶多糖，采用苯酚-硫酸法显色、紫外-可见分光计测定并计算纯度为69.16％。该文献还进一步公开了卡介苗联合脂多糖诱导小鼠出现免疫性肝损伤，当小鼠体内细胞接受到免疫攻击时，表现为内脏发生损伤，如肝脾肿大造成的指数升高以及免疫低下所致的胸腺缩小，这表明BCG联合LPS具有对靶器官特异攻击性。经金花茶多糖治疗后，小鼠脏器损伤程度明显减轻，与HE染色病理学检查的结果一致，这表明金花茶多糖通过恢复机体脏器活性而增强免疫力，从而抑制肝细胞的免疫毒性。上述文献虽然公开了金花茶多糖具有一定的免疫活性，但是免疫活性不高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种从金花茶叶中提取多糖的方法，该方法提取得到的多糖的免疫调节效果比现有的多糖显著提高。本专利技术提供的技术方案是从金花茶叶中提取多糖的方法，包括以下步骤：1)将金花茶叶加水提取，得到水提液；2)将水提液浓缩后，加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，再加入蛋白酶酶解，得到酶解液；4)将酶解液置于频率为1000～5000kHz超声波下处理15～60s，然后经截留分子量为14000的透析袋透析24～72h，取保留液经截留分子量为450000的透析袋透析24～72h，取透过液浓缩，再加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。步骤1)中，加水提取是指往金花茶叶中加入其重量20～30倍的水，回流提取2～3次，每次提取1～3h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液。步骤2)中，将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏。步骤2)中，所述加入乙醇沉淀是指往浓缩液中加入90～95v％的乙醇至醇含量为80～85v％。步骤3)中，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2～4倍，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2～4倍。步骤3)中，蛋白酶的用量为金花茶叶干重的0.3～3％，酶解温度为40～60℃，酶解时间为1～3h。蛋白酶可以将提取物中的大分子蛋白质酶解为多肽和氨基酸。步骤4)中，将酶解液置于频率为1000～5000kHz超声波下处理15～60s，可以将分子量极大的多糖(果胶)的部分糖链断开，降低分子量，降低粘度，提高水溶性，增强免疫活性。超声波处理时间为10～60s是为了确保仅断裂分子量大于45万的多糖的部分糖苷键，且多糖分子的断裂程度较小，不破坏活性单元，以达到降低分子量，提高水溶性，并增强免疫活性的目的。超声波处理后的酶解液先经截留分子量为14000的透析袋进行第一次透析，小分子色素、多肽和氨基酸和蛋白酶将透过透析袋滤除，大大提高保留液的纯度。再将保留液经截留分子量为450000的透析袋透析24～72h，得到分子量在14000至450000的金花茶多糖的流出液，所述透过液(流出液)浓缩是指浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏。所述加入乙醇沉淀是指往浓缩液中加入90～95v％的乙醇至醇含量为80～85v％。步骤5)中，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2～4倍，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2～4倍。本专利技术采用超高频率超声波将分子量极大的多糖分子(分子量在450000以上)中的部分糖苷键断裂，降低其分子量，降低粘度，提高水溶性，大大增强了终产物的免疫活性。经检测，终产物的纯度为98.6％以上。具体实施方式以下具体实施例对本专利技术作进一步阐述，但不作为对本专利技术的限定。实施例11)将金花茶干叶粉碎，加入其重量20倍的水，回流提取2次，每次提取1h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；2)将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.1的浸膏，加入90v％的乙醇至醇含量为80v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2倍，再加入金花茶叶干重0.3％的蛋白酶，在40℃下酶解时间为1～3h，酶灭活，得到酶解液；4)将酶解液置于频率为1000kHz超声波下处理15s，然后经截留分子量为14000的透析袋透析24h，取保留液经截留分子量为450000的透析袋透析24h，取透过液浓缩至60℃下相对密度为1.1的浸膏，加入90v％的乙醇至醇含量为80v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2倍，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。经检测，纯度为98.6％。实施例21)将金花茶干叶粉碎，加入其重量30倍的水，回流提取3次，每次提取3h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；2)将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.3的浸膏，加入95v％的乙醇至混合液中醇含量为85v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的4倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的4倍，再加入金花茶叶干重3％的蛋白酶，在60℃下酶解时间为3h，酶灭活，得到酶解液；4)将酶解液置于频率为5000kHz超声波下处理60s，然后经截留分子量为14000的透析袋透析72h，取保留液经截留分子量为450000的透析袋透析72h，取透过液浓缩至60℃下相对密度为1.3的浸膏，加入95v％的乙醇至醇含量为85v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的4倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的4倍，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。经检测，纯度为98.8％。实施例31)将金花茶叶粉碎，加入其重量25倍的水，回流提取2次，每次提取2h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；2)将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.2的浸膏，加入90v％的乙醇至混合液中醇含量为80v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙本文档来自技高网...

【技术保护点】
从金花茶叶中提取多糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将金花茶叶加水提取，得到水提液；2)将水提液浓缩后，加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，再加入蛋白酶酶解，得到酶解液；4)将酶解液置于频率为1000～5000kHz超声波下处理15～60s，然后经截留分子量为14000的透析袋透析24～72h，取保留液经截留分子量为450000的透析袋透析24～72h，取透过液浓缩，再加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。

【技术特征摘要】
1.从金花茶叶中提取多糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将金花茶叶加水提取，得到水提液；2)将水提液浓缩后，加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，再加入蛋白酶酶解，得到酶解液；4)将酶解液置于频率为1000～5000kHz超声波下处理15～60s，然后经截留分子量为14000的透析袋透析24～72h，取保留液经截留分子量为450000的透析袋透析24～72h，取透过液浓缩，再加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。2.根据权利要求1所述的从金花茶叶中提取多糖的方法，其特征在于：步骤1)中，加水提取是指往金花茶叶中加入其重量20～30倍的水，回流提取2～3次，每次提取1～3h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液。3.根据权利要求1所述的从金花茶叶中提取多糖的方法，其特征在于：步骤2)中，将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏。4.根据权利要求1或3...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹登峰，陈素一，黄晓，张小玲，肖胜军，
申请(专利权)人：桂林医学院，
类型：发明
国别省市：广西;45