一种矮生沿阶草r射线同质突变体库快速创制方法技术

本发明专利技术公开了一种矮生沿阶草r射线同质突变体库快速创制方法，包括如下步骤：1)高频体细胞胚外植体材料准备；2)早期体细胞胚外植体的培养；3)物理诱变剂准备；4)早期体细胞胚外植体的γ射线处理；5)体细胞胚分化培养；6)同质突变胚状体快繁増殖培养；7)同质突变胚状体的筛选及快繁増殖培养；8)成熟同质突变胚状体再生植株；9）同质突变体再生植株炼苗移栽；10) 田间突变体库建立。本发明专利技术快速构建矮生沿阶草r射线饱和同质突变体库的方法，不但为沿阶草功能基因组学、遗传育种问题的深入研究奠定了基础，同时为选育抗寒性强的矮生沿阶草新品种提供最直接有效的同质突变体材料，具有重要的理论意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种矮生沿阶草r射线同质突变体库快速创制方法
本专利技术属于植物育种领域，涉及一种植物同质突变体库构建的方法，尤其涉及一种通过物理诱变剂(60Co-γ射线)快速创制矮生沿阶草饱和基因同质突变体库的方法。
技术介绍
矮生沿阶草(Ophiopogonjaponicusf.nanus)属百合科沿阶草属中的矮生沿阶草种，具有强喜荫性、四季常绿、耐寒、耐热、再生能力强、观赏性好、耐践踏、管理容易等特点，适合于风景林下、建筑物遮荫处及复层绿化带下等特殊生境绿化、美化的草坪地被植物。矮生沿阶草作为一种重要的无性繁殖植物,不但品种改良近年来不断得到重视，其特有的一些生物学性状如矮生性和强耐荫性等也使得它成为寻找某些有重要利用价值的基因如矮生基因、耐荫基因等基因资源发掘利用的典型材料。分析鉴定基因的功能及基因之间的相互作用,基因对生长发育的影响，是功能基因组学的重点研究内容。目前尽管已经开发出了多种分析鉴定基因的新技术新方法,但最直接最有效的方法是构建饱和基因突变体库,通过突变体分析鉴定基因的功能。所以突变体库的构建是功能基因组学的研究基础。目前模式植物拟南芥、水稻等作物均已构建了饱和突变体库并进行了相关功能基因组学的研究，获得了一批有重要价值的创新种质资源。在众多的物理诱变剂中，60Co-γ射线因其可在一个基因组上产生多个点突变，且分布均匀，特别是r射线主要引起DNA片段的缺失和染色体重排，特别适用于多个家族基因功能缺失的突变体库的创建。尤其是其较小的突变群体便可获得变异丰富的饱和突变体库而成为一种应用广泛，即高效又稳定的物理诱变剂。同质突变体的获得：最快速有效的方法就是通过单个突变细胞的组培再生获得，由同质突变体获得的变异性状由于突变体无嵌合现象，所以是能够稳定遗传的，是组成同质突变体库的基础。但长期以来大部分植物组培再生都不是依赖于细胞水平上的再生，而是局限于个体或器官组织水平的再生。由多细胞组织器官诱变产生的再生植株后代，因其众多细胞基因突变的差异性往往导致突变体嵌合现象很严重，性状不稳定、重复性差、再生筛选时间延长，由于很难获得同质突变体，从而导致育种效率下降等一系列弊端。如何使一个单细胞发育成一棵完整植株，一直是许多植物组培再生的难题。目前的研究表明绝大多数植物体细胞胚起源于单细胞，体细胞胚胎发生途径重演了合子胚形态发生的过程，所以体细胞胚再生途径是再生种子来源、种苗脱毒快繁、诱导体细胞变异或基因转化的理想的受体系统。体细胞诱变、体细胞胚再生是快速获得广泛变异的同质突变体、避免嵌合体形成的理想方法，很容易在短时间内获得大量的变异丰富的同质突变体，是构建表型可见并且遗传稳定的突变体库的基础。因此体细胞物理诱变技术结合体细胞胚再生技术，是保证快速获得r射线同质突变体库的关键技术。研究表明：突变体的筛选较简单易行，已成为许多重要种质资源获得的有效途径，也是许多重要理论问题得以解决的前提。但突变体体细胞筛选结合体细胞胚再生的筛选方法有一定难度，目前报道还比较少见，它是定向同质突变体筛选成败的关键。目前国内外尚未发现利用遗传背景相同的矮生沿阶草体细胞通过r射线诱变处理,体细胞胚再生植株获得变异丰富的同质突变体及通过突变体体细胞筛选结合体细胞胚再生快繁获得定向同质突变体，以此构建矮生沿阶草r射线饱和同质突变体库的报道。因此本专利技术突破了以往大多数植物包括矮生沿阶草：1)虽以物理诱变方法创制了突变体，但构建突变体库的亲本材料的遗传背景不相同；2)突变体大多是以个体或器官组织发生途径再生的植株，从而导致突变体嵌合现象非常严重，也因此导致筛选时间延长甚至是无意义的筛选；3)由于突变体嵌合现象很严重，导致产生的性状很不稳定，延长了对突变体后代的筛选时间，且很难快速获得同质突变体，也就难以通过r射线快速构建起遗传稳定的变异丰富的及定向突变的饱和同质突变体库。因此本项专利技术提供的一种快速构建矮生沿阶草r射线饱和同质突变体库的方法，不但为沿阶草功能基因组学、遗传育种提供了更多的种质资源，同时也为选育矮生沿阶草新品种提供了最直接有效的突变体材料，具有重要的实用价值。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术的不足，本专利技术主要解决的问题是提供一种体细胞r射线诱变、定向筛选及与体细胞胚再生相结合，快速构建矮生沿阶草r射线饱和同质突变体库的一种优化方法。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种矮生沿阶草r射线同质突变体库快速创制方法，该方法包括如下步骤：1)高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的矮生沿阶草植株，取其幼嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5-1.0cm大小外植体，通过高频体胚再生系统的培养，就会持续不断地产生体细胞胚和胚状体及完整地再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；2)早期体细胞胚外植体的培养：将上述具高频体细胞胚再生能力的外植体切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上25-28℃无菌室暗培养7-10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；3)物理诱变剂准备：包括60Co-γ射线源准备及辐射剂量的设置；60Co-γ射线源由江苏里下河地区农业科学研究所提供；4)早期体细胞胚外植体的γ射线处理：将早期体细胞胚外植体分成8组，用于8个不同辐射剂量的处理；5)体细胞胚分化培养：将经γ射线诱变处理过的早期体细胞胚外植体，重新放回无菌室在温度25-28℃下暗培养50-60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期突变胚状体；常温暗培养可保证快速获得具广泛基因变异的遗传稳定的同质饱和突变体材料。6)同质突变胚状体快繁増殖培养：将上述早期突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25-28℃光下培养50-60d，中间继代一次，可获得大量成熟的同质突变胚状体；7)同质突变胚状体的筛选及快繁増殖培养：将上述快繁的各类同质突变胚状体取出一部分，切成0.5cm大小块，分别编号继续转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放入5-8℃低温无菌培养箱中弱光下(500-800lx)培养25-30d，之后再继代转入25-28℃光下(1500-2000lx)培养25-30d，可获得抗冷性较强的成熟同质突变胚状体；8)成熟同质突变胚状体再生植株：是将上述快繁増殖的具丰富变异的成熟突变胚状体及抗冷性强的成熟突变胚状体均分别编号转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25-28℃光下培养20-25d，获得具根、茎、叶完整的同质突变体再生植株；9)同质突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1-1.5cm时,将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；成活率可达100％。揭去培养瓶的封口膜,在室内炼苗1～2d，用镊子小心取出小苗,洗净根上附着的培养基，移栽到装有轻型基质(泥炭:蛭石＝1:1)的花盆中，放入温室温度为24℃～26℃，适当遮荫,或将小苗放到苗床下,自动间歇喷雾装置浇水。10)田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在同质突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选，以此建立起沿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种矮生沿阶草r射线同质突变体库快速创制方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1) 高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的矮生沿阶草植株，取其幼嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5‑1.0cm大小外植体，通过高频体胚再生系统的培养，就会持续不断地产生体细胞胚和胚状体及完整地再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；2)早期体细胞胚外植体的培养：将上述具高频体细胞胚再生能力的外植体切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上25‑28℃无菌室暗培养7‑10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；3) 物理诱变剂准备：包括60Co‑γ射线源准备及辐射剂量的设置；4) 早期体细胞胚外植体的γ射线处理：将早期体细胞胚外植体分成8组，用于8个不同辐射剂量的处理；5) 体细胞胚分化培养：将经γ射线诱变处理过的早期体细胞胚外植体，重新放回无菌室在温度25‑28℃下暗培养50‑60d，中间继代一次，有利于体细胞胚分化，可见外植体上大大小小生长发育出几十个早期突变胚状体；6) 同质突变胚状体快繁増殖培养：将上述早期突变胚状体切成0.5cm大小块，分别编号转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放在25‑28℃光下培养50‑60d，中间继代一次，可获得大量成熟的同质突变胚状体；7) 同质突变胚状体的筛选及快繁増殖培养：将上述快繁的各类同质突变胚状体取出一部分，切成0.5cm大小块，分别编号继续转接于体细胞胚快繁增殖培养基，放入5‑8℃低温无菌培养箱中弱光下（500‑800lx）培养25‑30d，之后再继代转入25‑28℃光下（1500‑2000lx）培养25‑30d，可获得抗冷性较强的成熟同质突变胚状体；8) 成熟同质突变胚状体再生植株：将上述快繁増殖的具丰富变异的成熟突变胚状体及抗冷性强的成熟突变胚状体均分别编号转接于植株再生培养基中，在无菌室温度25‑28℃光下培养20‑25d，获得具根、茎、叶完整的同质突变体再生植株；9）同质突变体再生植株炼苗移栽：当根长生长到1‑1.5cm时，将各突变体株系分别编号移栽到花盆，选择轻型基质，放置在温室大棚内，自动间歇喷雾装置浇水；10) 田间突变体库建立：60d后选择温暖湿润阴天将各个突变体株系移栽到室外林下或田间区试圃，分别编号，记载相关性状，在同质突变体生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选，以此建立起沿阶草γ射线饱和同质突变体库。...

【技术特征摘要】
1.一种矮生沿阶草γ射线同质突变体库快速创制方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1)高频体细胞胚外植体材料准备：选取室外健康无病虫害的矮生沿阶草植株，取其幼嫩茎叶，无菌消毒后在无菌培养基中组培成无菌试管苗，取其茎叶基部0.5-1.0cm大小外植体，放在体胚发生诱导培养基上暗培养50-60d，中间继代一次，将产生的初生胚状体转入高频体细胞胚培养基上光下培养50-60d，中间继代一次，就会持续不断地大量产生球形胚、鱼雷胚和子叶胚发育时期的体细胞胚，将子叶胚转入无激素的成苗培养基培养，20-25天后形成完整再生植株，以再生植株作为高频体细胞胚外植体材料来源；所述无菌培养基为1/2MS+2.0mg/LBA+0.5mg/LNAA+20g/L蔗糖+0.7%琼脂，所述体胚发生诱导培养基为MS+BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+2，4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+3.5g/Lphytagel；所述高频体细胞胚培养基为MS+BA2mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖40g/L+3.5g/Lphytagel；成苗培养基为MS+白糖30g/L+0.7%琼脂；2)早期体细胞胚外植体的培养：将上述具高频体细胞胚再生能力的外植体切取其叶、茎基部0.5cm大小组织块，放在体胚发生诱导培养基上25-28℃无菌室暗培养7-10d，此时大部分体细胞为单细胞时期，称作早期体细胞胚，以此作为诱变剂处理材料；所述体胚发生诱导培养基为MS+BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+2，4-D0.5mg/L+蔗糖30g/L+3.5g/Lphytagel；3)物理诱变剂准备：包括60Co-γ射线源准备及辐射剂量的设置；4)早期体细胞胚外植体的γ射线处理：将早期体细胞胚外植体分成8组，用于8个不同辐射剂量的处理；辐射剂量设置：设置为0.0、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy8个不同处理；5)体细胞胚分化培养：将经γ射线...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁慧敏，贾君，颜志明，董慧，杨宝林，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32