本发明专利技术涉及具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的乳酸菌的分离、筛选及鉴定，具体是一种植物乳杆菌及其应用。从广西巴马长寿人群肠道中分离乳酸菌，在比较耐酸及耐胆盐特性，体外抗氧化能力，对抗生素具敏感性综合比较基础上，通过体外试验筛选出一株具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力最强的菌株，经生理生化试验、API试剂条及16s rDNA测序分析，将该菌株鉴定为植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum Grx16)。该菌株可用于制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的发酵乳。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及具有对a-葡萄糖苷酶具有抑制作用的乳酸 菌的分离、筛选方法及鉴定。
技术介绍
糖尿病是一组以高血糖为特征的全身代谢疾病，高血糖是则由于胰岛素分泌缺陷 或其生物作用受损，或两者兼有而引起的症状。随着当今世界经济的发展、人类寿命的延 长，糖尿病患者的数量也与日倶增，糖尿病已经变成全球性的威胁。药物和胰岛素替代已被 广泛用于治疗糖尿病，但药物的副作用可能会导致身体不适等其他病状的产生，即使直接 使用胰岛素注射也可引发注射部位肌肉萎缩、视力模糊等副作用，这使得药物治疗在临床 应用中受到了很大程度的限制。本研究从广西巴马长寿人群肠道中分离和筛选乳酸菌，筛 选出具有体外a-葡萄糖苷酶抑制优秀能力的乳酸菌，从而利用该乳酸菌进行发酵，进而 制备出具有调节血糖、促进身体健康功能的保健型发酵食品类，逐渐开创我国功能食品消 费的新市场。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供具有优异体外抑制a_葡萄糖苷酶活性能力的益生菌菌株 及其应用。 本专利技术提供了 1 株植物乳杆菌Grxl6(Lactobacillusplantarum.Grxl6)，该菌具 有优秀体外抑制a-葡萄糖苷酶活性能力，保藏号是CGMCCNO. 10921。 本专利技术经试验证明，该菌株耐人工胃液及胆盐，具有优秀的体外抑制a-葡萄糖 苷酶活性能力，同时具有较强的还原能力、DPPH自由基清除能力优秀且耐药性较低；并通 过生理生化、API试剂条和16SrDNA序列比对分析将该菌株鉴定为植物乳杆菌。 本专利技术还提供了植物乳杆菌Grxl6(Lactobacillusplantarum.Grxl6)在制备具 有抑制a-葡萄糖苷酶活性能力的发酵乳中的应用。 本专利技术还提供了植物乳杆菌Grxl6(Lactobacillusplantarum.Grxl6)在制备具 有抑制a-葡萄糖苷酶活性能力的发酵骆驼乳中的应用。 本专利技术的植物乳杆菌Grxl6(Lactobacillusplantarum.Grxl6)具有优秀的体外 抑制a_葡萄糖苷酶活性能力，并耐人工胃液及胆盐，同时具有较强的还原活性、DPPH自 由基清除能力，对多种抗生素敏感，可用于制备发酵乳与功能食品研发，具有很好的市场前 景。【附图说明】 图1为本专利技术菌株的形态图。 图2为本专利技术菌株16SrDNAPCR扩增产物电泳图。泳道M:100+2+3KbDNAmaker; 泳道1为：Grxl6 16SrDNA扩增产物。 植物乳杆菌Grxl6(Lactobacillusplantarum.Grxl6)，于 2015 年 8 月 7 日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillusplantarum.)保藏 号是CGMCCNo. 10921。【具体实施方式】 本研究采用传统涂布平板法从广西巴马长寿村采集的样品中分离乳酸菌，通过模 拟人体胃肠道环境筛选出耐酸耐胆盐能力较强的菌株，并研究其还原活性、DPPH自由基清 除能力以及耐药性，最后通过体外试验筛选出对a-葡萄糖苷酶抑制能力最强的菌株。 实施例一：菌株的分离、筛选方法及鉴定。 1、样品米集 采集广西巴马长寿村中长寿人群及其家族人群样品，加入lmL灭菌液体石蜡油密 封后，迅速置于冰盒内，分离样品中的乳酸菌。 2、乳酸菌的分离 将采集的样品经梯度稀释后，分别接种于MRS固体培养基、LBS固体培养基和PTYG 固体培养基中，37°C厌氧培养48h，挑取平板上的典型菌落，划线分离得到纯菌落。挑取各平 板上的纯菌落于MRS液体培养基中，37°C厌氧培养24h后，4°C冰箱冷藏备用或冻干保藏。 3、乳酸菌的生理生化试验 对分离到的乳酸菌进行革兰氏染色，于显微镜下观察菌体形态，并进行接触酶、运 动性、硝酸盐还原及吲哚等生理生化试验。 结果表明，从采集的样品中分离获得197株菌株，通过生理生化试验发现180株菌 革兰氏染色为阳性，形状为杆状、短杆状或球状，在15°C及45°C环境下均能生长，接触酶、 运动性、硝酸盐还原、吲哚、产H2S及明胶液化试验均为阴性，所以将180株菌初步鉴定为乳 酸菌。 4、乳酸菌凝乳性的筛选 将180株试验菌株活化后接种于脱脂乳中，37°C静置48h，并观察凝乳状况，所有 菌株的凝乳情况见表1。 表1试验乳酸菌发酵24h凝乳情况 注：++为凝固，且凝乳质地均匀细致，凝乳时间较短，凝块结实，无乳清析出；+为 凝固，但凝块不结实，凝乳时间较长，乳清析出较多. 结果显示，180株乳酸菌中，有136株在48h内凝乳，并且各菌株的凝乳时间有较大 的差异。因此将筛选出的136株乳酸菌用于进一步筛选试验。 5、乳酸菌耐酸耐胆盐能力的测定 将活化好的乳酸菌制成菌悬液，取1.OmL的菌悬液接种至9.OmL的pH3. 0人工胃 液中，37°C培养，分别在Oh和3h用平板计数法测定活菌数，计算其存活率（％ )。 存活率（％ )= 3h的活菌数/Oh的活菌数X100% 将活化好的乳酸菌按3 %的接种量分别接种至含0.00 % (即空白）、0. 10%、 0. 30%及0. 50%胆盐的MRS培养基中，37°C培养，分别在Oh和3h用平板计数法测定活菌 数，计算其存活率（％ )。 存活率（％ )= 3h的活菌数/Oh的活菌数X100% 乳酸菌的活菌浓度必须达到106cfu/mL才能在肠道中发挥生理功能，所以乳酸菌 在进入人体消化道后，需要具有同时能够耐受较低的pH以及较高浓度的胆盐能力。而分离 的乳酸菌需要在人体内存活，则需要测试在模拟人体肠液和胃液的人工肠液、胃液中的存 活率，筛选出的136株凝乳性能较好的乳酸菌中25株乳酸菌对人工胃液、人工胆盐和人工 肠液的耐受率处于较高的水平，部分结果见表2。 表2乳酸菌的耐酸耐胆盐能力 结果表明，25株菌株在pH为3. 0的人工胃液中均有一定的耐受性，且存活率均大 于70%，其中菌株Y6、R10、R4、M4存活率大于70.0%。菌株对胆盐均有一定的耐受性，存 活率在36. 0 % -50. 0 %之间，而菌株Yl、R4、G5、G6、S8存活率均大于47. 0 %。而对人工肠 液耐受能力较好的菌株有R7、Yl、Y4、Y6、D12等，而在人工肠液中25株菌株存活率均大于 45%〇 6、乳酸菌体外抗氧化能力的测定 取发酵液上清2mL，加入2mLDPPH?无水乙醇溶液（0. 2mmol/L)，摇匀，避光反应 30min，6000r/min离心lOmin，取上清液于517当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum Grx16)，其保藏号是CGMCC NO.10921。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：顾瑞霞，石雪晨，印伯星，孟茜，陈霞，黄玉军，瞿恒贤，蒋欣荣，瓦云超，陈大卫，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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