一种用次血红素六肽测定血清总胆固醇方法，属于生物、医学技术领域，其方法是：在全自动生化分析仪520nm波长处测定反应前后吸光度值的变化即△A，通过与同样测定的胆固醇标准品比对，计算出总胆固醇的量；胆固醇的量即mmol/L=△A样本/△A标准×标准品浓度。有益效果是：本发明专利技术结合现代生物学技术原理研发的检测方法，具有灵敏度高、稳定性好及经济实用等特点，可广泛应用于医药卫生及食品生产企业、农贸市场、质量监督等部门对液体样品中总胆固醇量进行监测的领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物、医学
，涉及一种与生物、医学检测方法的改进。
技术介绍
： 胆固醇，别名胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物，化学式为C27H46O13 胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和 胆汁中含量也高。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜， 而且是合成胆汁酸，维生素 D以及留体激素的原料。 胆固醇在血液中存在于脂蛋白中，其存在形式包括高密度脂蛋白胆固醇、低密度 脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇几种。血液中总胆固醇浓度的参考范围为2. 9~ 5. 2mmol/L，当血液中总胆固醇浓度高于参考范围时，易引发人心、脑血管疾病。因此，总胆 固醇测定在疾病诊断中是一种常规检验项目。 总胆固醇的测定方法目前已超过200种，可分为化学试剂比色法、酶分析法、荧光 法、气相和高效液相色谱法等五大类。由于气相和高效液相色谱法条件高，临床实验室最常 用的是化学试剂法和酶分析法。化学试剂法由于存在操作复杂、试剂有强腐蚀性(浓硫酸） 和不易自动化的缺点，现在已很少应用。目前血清中总胆固醇的酶法测定是依据国家标准 WS/T 120-1999进行的，其原理： 血清（浆）中总胆固醇（TC)包括游离胆固醇（FC)和胆固醇酯（CE)两部分。血清中CE 可被胆固醇酯酶（CEH)水解为FC和游离脂肪酸（FFA)。FC在胆固醇氧化酶（CHOD)的作用 下生成Λ 4-胆甾烯酮和过氧化氢（H2O2)，H2O2在4-氨基安替比林（4AAP)和3, 5-二氯-2 羟基苯磺酸钠（DHBS)存在时，经过氧化物酶（POD)催化，反应生成最大吸收波长在520nm的 亚醌胺的红色化合物，其吸光度值与标本中TC含量成正比。该法具有操作简单、试剂无腐 蚀性和可全自动操作的特点，是目前大多临床实验室应用的测定方法。 在酶法测定总胆固醇的试剂中，过氧化物酶（POD)是色源产生的关键物质。 POD是一类从植物、动物、微生物中提取出来的氧化还原酶。在生命活动过程中， 其主要是催化分解生物体内的氧化物或过氧化物以及氧化分解其它毒素。由于POD是蛋白 质，可在储存、运输、应用等环节导致酶的活性下降，进而影响总胆固醇的测定准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供，它利用三价 铁卟啉DhHP-6具有过氧化物酶功能的原理，替代过氧化物酶，制备一种总胆固醇检测试 剂，建立一种对液体样品中总胆固醇进行定量测定的检测方法。通过检测反应后光吸光度 的变化，计算出待测液体样品中总胆固醇的量。本专利技术的测定方法是： 在自然界中各种POD虽然具有共同的生物活性，但并不具有相同或相似的结构和作用 机理。其中含金属卟啉环的血红素过氧化物酶（HPX)是一类结构相似，功能相同的酶类， 属于血红素 PX蛋白超家族成员。以血红素为辅基的过氧化物酶的结构，设计合成一个具 有过氧化物酶活性的模拟物，命名为：次血红素六肽（DeuteroheminAlaHisThrValGluLys, DhHP-6)。 DhHP-6分子量1228. 48,分子式是C59H74FeN13tn3，是一种小分子化合物，化学性质 非常稳定，在储存、运输、应用等环节无活性下降，而且价格低廉。 a、检测步骤在全自动生化分析仪520nm波长处测定反应前后吸光度值的变化(Λ A)，通过与同样 测定的胆固醇标准品比对，计算出总胆固醇的量。 胆固醇的莖（rnm〇l/L) = Δ A样本/ Δ A标准X标准品浓度。 b、试剂组成 ①磷酸盐缓冲液，离子强度300mmol/L，pH7. 7。 ②胆固醇酯酶（Cholesterol esterase, CEH;EC 3. I. I. 13) ③胆固醇氧化酶（Cholesterol oxidase，CH0D;EC 1.1.3.6) @ DhHP-6 ⑤ Triton X-100 ⑥ 胆酸钠 ⑦ 4-氨基安替比林（4-AAP) ⑧ 3, 5-二氯-2羟基苯磺酸钠（DHBS) 在磷酸盐缓冲液中分别加入以上物品，溶解后2~8°C保存备用。 C、操作过程 ① 在37°C水浴中将试剂加入到3个试管中（F、B、C)，1分钟后再将液体样品、标准液 和水分别加入到F、B、C试管中，混匀，反应10分钟； ② 在分光光度计(全自动生化分析仪)520nm波长处测定F、B、C吸光度值，Λ A#+ =Af-Ac，Λ Aes =Ab-Ac。通过与同样测定的胆固醇标准品比对，计算出总胆固醇的量。 胆固醇的量（mmol/L) = Λ A样本/ Λ A标准X标准品浓度。 本专利技术的有益效果是：本专利技术结合现代生物学技术原理研发的检测方法，具有灵 敏度高、稳定性好及经济实用等特点，可广泛应用于医药卫生及食品生产企业、农贸市场、 质量监督等部门对液体样品中总胆固醇量进行监测的领域。【附图说明】 图1是DhHP-6分子结构图。 图2是两种试剂测定不同浓度H202的线性及相关性（3h)。 图3、两种试剂测定血清样本总胆固醇的相关性。 图4是表1的DhHP-6试剂测定H2O2。 图5是表2的总胆固醇测定试剂盒测定H2O2。 图6是表3的两种试剂测定不同浓度H202的稳定性比较。 图7是表4的DhHP-6试剂测定血清总胆固醇。【具体实施方式】 实施例1 图 2 中，，: 、X 轴为 H2O2 (mmo I/L )、y 轴为吸光度值。 图3中，总胆固酵试:剂、X轴为总胆固醇浓度（rnmol/L)、y轴为吸 光度值。 (一）试剂配制： 1、DhHP-6试剂组成：在pH7. 7的300mmol/L磷酸盐缓冲液中，分别加入CEH彡800U/ L、CHOD 彡 400U/L、DhHP-6 1.0 mmol /UTriton X-100 3%、胆酸钠 3. 0mmol/L、4-AAP 0.5 mmol/L、DHBS 3.5mmol/L〇 2、胆固醇标准液5· 2mmol/L (长春汇力生物技术有限公司）。 3、3%过氧化氢（山东德州新康消毒制品有限公司） 4、总胆固醇测定试剂盒(长春汇力生物技术有限公司，吉食药监械(准）字2011第 2400064, YZB/ 吉 0208-2010)。 (二）实验方法(手工）： 1、以H2O2为底物的实验步骤： (l)、DhHP-6试剂具有过氧化物酶功能，可致H2O2分解而产生0。因此可采用不同浓度 的H2O2进行实验观察。 (2)、将 3. 0% H2O2稀释成浓度为 22. 0、11· 0、5· 50、2· 75、L 375mmol/L 备用。 (3)、分别取蒸馏水、DhHP-6试剂（自配)、总胆固醇测定试剂盒(汇力生物)、不同浓 度H 2O2溶液。按表1、2操作，37°C分别在1/6小时（10分钟)、1. 0小时、3. 0小时和24小时 测定520nm处吸光度值。两种试剂测定不同浓度H202的线性、稳定性及相关性见表3、图 2〇 以H2O2为底物的实验结果显示，DhHP-6试剂测定不同浓度H202有较好的线性、稳 定性及与商品试剂盒有良好的相关性。 2、总胆固醇检测方法： (1)、取总胆固醇8. 62mmol/L的血清样本，加生理盐水分别稀释成浓度4. 31、2. 16、 L 08、0· 54mmol/L 备用。 (2)、取不本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用次血红素六肽测定血清总胆固醇方法，其方法是：a、检测步骤在全自动生化分析仪520nm波长处测定反应前后吸光度值的变化即△A，通过与同样测定的胆固醇标准品比对，计算出总胆固醇的量； 胆固醇的量即mmol/L=△A样本/△A标准×标准品浓度；b、试剂组成①磷酸盐缓冲液，离子强度300mmol/L,pH7.7；②胆固醇酯酶即Cholesterol esterase,CEH;EC 3.1.1.13；③胆固醇氧化酶即Cholesterol oxidase ,CHOD;EC 1.1.3.6；④DhHP‑6；⑤Triton X‑100；⑥胆酸钠⑦4‑氨基安替比林即4‑AAP；⑧3,5‑二氯‑2羟基苯磺酸钠即DHBS； 在磷酸盐缓冲液中分别加入以上物品，溶解后2～8℃保存备用；C、操作过程① 在37℃水浴中将试剂加入到3个试管中的F、B、C，1分钟后再将液体样品、标准液和水分别加入到F、B、C试管中，混匀，反应10分钟；② 在分光光度计520nm波长处测定F、B、C吸光度值，△A样本=AF—AC，△A标准=AB—AC；通过与同样测定的胆固醇标准品比对，计算出总胆固醇的量； 胆固醇的量即mmol/L=△A样本/△A标准×标准品浓度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯玥，张昊，于源华，
申请(专利权)人：长春理工大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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