本发明专利技术公开了一种microRNA-miR-145作为快速检测母猪胚胎存活的应用，所述miRNA分子标志物在胚胎存活数少的母猪子宫内膜组织中异常高表达，并通过组织的主动分泌过程分泌到血清中，随后通过检测大样本胚胎存活数少母猪血清miR-145表达水平，发现血清miR-145是一种可以快速检测母猪胚胎存活的分子标记物；本发明专利技术通过预测母猪胚胎存活率，尽早淘汰胚胎存活差的母猪，进而有效提高养猪企业的经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种用于快速检测母猪胚胎存活的miRNA 分子标记miR-145、miR-145的引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
提尚母猪广仔数可以提尚母猪繁殖性能，进而有效提尚养猪企业的经济效益。胚 胎存活率是影响母猪产仔数的重要因素之一。在养猪生产，如何尽早淘汰胚胎存活差的母 猪，成为了困扰生产者的一道难题。目前在生产中淘汰胚胎存活差母猪的方法主要通过观 察母猪21天返情率和流产率实现。这种方法不仅费时费力，还会造成大量饲料和人力成本 的浪费，给养猪生产的利益造成损失。因此我们亟需建立一种能在配种前快速检测母猪胚 胎存活的方法。这将大大节约猪场生产成本，提高其经济效益。 母猪在怀孕期间胚胎和胎儿的损失大约30%~50%，其中超过75%的损失发生 在配种后的前25d(即胚胎附植期）。研究发现围植入期子宫内膜发育不良是导致母猪怀孕 后前30d胚胎损失的一个关键因素。miRNAs是一类长度为19-25个核苷酸非编码小RNA， 在进化过程中高度保守、并在各组织细胞中特异性表达。越来越多研究发现miRNAs通过转 录后调控基因表达参与多种生物学信号通路的调节，在很多与子宫内膜相关疾病的发生和 发展过程中扮演极其重要角色，可以用来预测不孕、子宫内膜癌、子宫内膜异位等的分子标 志物。越来越多研究证据已经表明miRNA作为一种调控因子在调节早期胚胎发育和胚胎存 活等过程中发挥重要作用。有研究结果表明，血清中miRNA分子是由组织中的miRNA主动 分泌而获得的，因此通过分析胚胎存活差母猪子宫内膜组织miRNA的表达谱，然后在血清 中筛选差异表达的miRNA，将会是一种寻找母猪胚胎存活分子标记物行之有效的办法。 因此本专利技术根据上述思路开发了一种miRNA分子作为快速检测母猪胚胎存活的 分子标志物，通过RT-PCR技术检测微量血清样品中这种分子标志物的表达水平来预测母 猪胚胎存活。
技术实现思路
本专利技术针对上述存在的问题作出改进，提出一种用于快速检测母猪胚胎存活的 miRNA分子标记。 本专利技术是通过以下技术方案实现的： 本专利技术通过microRNA基因芯片从胚胎存活数少的母猪子宫内膜中筛选出异常高 表达的microRNA，并通过realtimePCR验证，最终明确miR-145与胚胎存活高度相关，可以 作为快速检测胚胎存活的标记物。 因为胚胎存活数少母猪子宫内膜中异常高表达的miR-145可以通过组织的主动 分泌过程分泌到血清中，所以本专利技术重点分析了胚胎存活数少母猪血清miR-145的成熟体 (其序列为5' -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU-3'，如SEQIDN0:1所示）的表达情况，首次 发现血清miR-145可以作为快速检测母猪胚胎存活分子标志物进行应用。具体应用时，在 母猪配种前半小时采集血样，采用RealtimePCR检测血清中miR-145的表达水平。若能检 出，则该母猪应该被淘汰。 为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于快速检测母猪胚胎存活的miRNA分子标 记miR-145,所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQIDNO: 1所示，所述miRNA分子标记 物在胚胎存活数少母猪子宫内膜组织中异常高表达，并通过组织的主动分泌过程分泌到血 清中；分泌至血清中的核苷酸分子标记miR-145用于母猪胚胎存活的快速检测。 为实现上述目的，本专利技术还提供了用于检测所述分子标记miR-145引物对，其特 征在于：核苷酸序列如下：前向引物：5' -GTCCAGmTCCCAGGAATCCCTTA-3'，如SEQIDN0. 2 所示； 逆向引物序列为通用的适配子引物。 所述引物对特异性扩增出SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。 为实现上述目的，本专利技术还提供了一种用于快速检测母猪胚胎存活的试剂盒，包 括上述的引物对。 所述的试剂盒，还包括2. 5U/y1PolyA聚合酶、逆转录酶、5X逆转录缓冲液、去 RNA酶水、2XqPCR混合液、70 %乙醇、血清裂解液、氯仿和无水乙醇。 所述试剂盒的具体组成如下： 2. 5U/y1PolyA聚合酶 20y1; 逆转录酶20yl; 5X逆转录缓冲液100y1 ; 去RNA酶水 1000y1 ; 2XqPCR混合液 2000y1 ; 50um上游特异引物20y1 ; 50um下游适配引物20y1; 内参上游引物20yl; 内参下游引物20yl; 血清裂解液100ml ; 70 % 乙醇 100ml;氯仿100ml ; 无水乙醇100ml。 采用上述试剂盒检测miR-145的具体方法为： (l)microRNA的提取： ①取母猪的外周血血清400y1，加入750y1裂解液MRL，吹打几次，剧烈震荡混 勾，在室温下孵育5min，小心吸取上清转入一个新的RNasefree的离心管中。 ②加lmLTrizol试剂，混匀，室温下放置10分钟。4°C12000rpm离心15分钟。 ③取上清液到1. 5mL的去RNase的EP管中，加入200y1氯仿，剧烈振荡混匀30 秒，使水相和有机相能充分混合，室温静置15分钟，4°C12000rpm冷冻离心10分钟。 ④吸取上层水相部分移至另一个新的去RNase的EP管，加入0.5mL异丙醇，震荡 混匀后室温下静置10分钟，4°C12000rpm冷冻离心10分钟。 ⑤去上清，加入70%乙醇以沉淀RNA成份，并加入适量的DEPC水将其溶解。 (2)miR_145 的检测： ①按照得到的RNA+逆转录缓冲液5y1+逆转录酶1y1+2. 5U/y1聚合酶1y1+ 去RNA酶水补足到25y1。 ②37°C水浴60min ;85°C水浴5min后放于冰上，得到的microRNAcDNA。③cDNA2yl+2xqPCR混合液 10y1+ 引物（2yM) 2y1+ 通用引物（2yM) 2y1+DDW 4yl〇 ④预变性95°C 5min -(变性30秒一退火60°C 30秒一延伸72°C 30秒）40个循 环熔解曲线72°C -95°C 0? 5°C /10秒一冷却25°C 30秒。 ⑤根据得到的Ct值，减去内参基因，代入2-A ACT，得到miR-145在该母猪血清中 的表达值。 为实现上述目的，本专利技术还提供了一种用于检测血清miR-145成熟体的特异性扩 增的方法，其特征在于：包括如下步骤：首先进行血清microRNA的抽提，然后在poly(A)聚 合酶在其3'末端加polyA尾，在反转录酶的作用下反转录为cDNA，并进行RealtimePCR 扩增。 为实现上述目的，本专利技术还提供了下述任一应用： (1)上述的分子标记在预测母猪胚胎存活中的应用； (2)上述的引物对在预测母猪胚胎存活中的应用； (3)上述的试剂盒在预测母猪胚胎存活中的应用； (4)上述的方法在预测母猪胚胎存活中的应用。 本专利技术的有益效果： 本专利技术利用microRNA基因芯片检测和比较胚胎存活数少和正常对照的母猪子宫 内膜microRNA表达谱差异，从中筛选出候选microRNA，通过realtimePCR进行验证，发现 miR-145可以作为检测母猪胚胎存活的分子标记物。异常高表达的miR-145可以通过组织 的主动分泌过程分泌到血清中，因此随本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于快速检测母猪胚胎存活的miRNA分子标记miR‑145，其特征在于：所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述miRNA分子标记物在胚胎存活数少母猪子宫内膜组织中异常高表达，并通过组织的主动分泌过程分泌到血清中。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴德，周盼，方正锋，车炼强，徐盛玉，林燕，冯斌，李建，陈玲，赵希仑，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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