本发明专利技术涉及一种具有杀虫活性的猪源化改型抗体及其制备方法与应用，通过生物信息学预测猪源化抗体重、轻链可变区的8个FR，并植入抗独特型单链抗体A12的6个CDR来确定猪源化改型抗体的序列，进行人工合成，从而构建A12的猪源化的改型抗体，并通过替换易于噬菌体表达的PIT2载体，获得猪源化改型抗体；该改型抗体与小菜蛾中肠BBMV具有一定的结合能力，且具有杀虫活性；本发明专利技术利用生物信息学预测和人工合成的方法可快速高效的地获得动物来源的改型抗体，使用这些基因工程抗体技术探索开发新型且安全性高的杀虫蛋白资源的可能性，也为发展新型杀虫白提供了新的思路和方向。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物农药领域，特别是一种具有杀虫活性的猪源化改型抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)的Bt毒素蛋白是目前最为有效的抗虫资源，但经报道的新高效株系越来越少(Bravoetal.,2013；Bravoetal.,2011)而Bt毒素使用量增加使其在害虫抗药性及次生害虫上升等方面存在生态风险，这一现状促使高特异活性和新功能类的Bt毒素抗虫资源的积极开发(BravoandSoberon,2008；Pigottetal.,2008)。因此，模拟Bt毒素杀虫蛋白的筛选，开发其它类型的杀虫蛋白，尤其是安全性更高的蛋白资源，是解决这些问题的有效途径之一。独特型抗体（Anti-idiotypicantibody,Anti-Id）理论以及人源化的抗体库筛选技术可以获得具有模拟特定抗原（BtCry毒素）结构及功能的肽活性材料,目前所公开的模拟的BtCry毒素包括：Cry1Ab（公开号为CN103773774A的中国专利）、Cry1B（公开号为CN103773775A的中国专利）、Cry1C（公开号为CN103773776A的中国专利）、Cry2A（公开号为CN104498501A的中国专利），经过测鉴定，这些人源化的Cry毒素Anti-Id都具有一定的杀虫活性，由此可见，抗独特型抗体制备技术是开发新型杀虫蛋白的一个新途径。抗体分子可以分为轻链（lightchain）和重链（heavychain）两部分，而轻链和重链又分别可以分为可变区（variableregion,V区）和恒定区（constantregion,C区）。抗体分子的恒定区是决定抗体分子结构中免疫原性的部位，而抗体的可变区则决定了抗体分子的特异性。轻链可变区（lightchainvariable，VL）或者重链可变区（heavychainvariable，VH）都是由4个骨架区（frameworkregion，FR）和3个互补决定区（complementaritydeterminingregion，CDR）交替排布连接而成。抗体V区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性（周光炎，2007）。将人源单链抗体的CDR移植至其他动物来源抗体可变区，替代其他动物来源抗体CDR，使其他动物来源抗体获得人源单链抗体的抗原结合特异性，扩展杀虫蛋白基因资源的来源谱系，类似的这种技术手段在医学研究上已见报道（Jones,etal.,1986；Irieetal.,1989；Sompurametal.,1996；Wuetal.,1999；Hamannetal.,2002），这种改型抗体（reshapedantibody），也称CDR植入抗体（CDRgraftingantibody），比嵌合抗体（chimericantibody）更进了一步。Cry1Ab毒素抗独特型单链抗体由于可模拟Cry毒素并与其竞争受体蛋白，将杀虫效果较好的抗独特型单链抗体CDR区取代到其他动物来源的单链抗体上相应的CDR区，穿插在各种来源抗体的8个FR之间，即在动物源抗体的基础上将动物源抗体CDR区基因替换为人源抗体CDR区基因，可快速获得多种动物来源的改型抗体，获得多种动物来源的杀虫蛋白资源，使用这些基因工程抗体技术探索开发新型且安全性高的杀虫蛋白资源的可能性，也为发展新型杀虫白提供了新的思路和方向，目前，上述抗虫基因分子改造的方法未见公开报道。
技术实现思路
为实现开拓多种动物来源的杀虫蛋白资源之目的，本专利技术提供一种具有杀虫活性的猪源化改型抗体及其制备方法与应用，该猪源改型抗体对小菜蛾（Plutellaxylostella）具有较高的杀虫活性，本专利技术是这样实现的：一种具有杀虫活性的猪源化改型抗体，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。如本专利技术所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体的制备方法，具体步骤如下：（a）由GenBank筛选猪源抗体，并分别对其VH和VL进行氨基酸序列比对分析，确定保守序列，再根据IMGT鉴定方法分别确定VH和VL的FR1、FR2、FR3和FR4；其中，VH和VL序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；（b）将人源化抗独特型单链抗体A12的6个CDR植入猪源抗体的相对应部分，再加上连接重、轻链的(GGGGS)3Linker，即获得猪源抗体，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；反向翻译所述猪源抗体氨基酸序列，并且在获得的核苷酸序列两端加上NcoI、NotI酶切位点及对应的碱基保护核酸序列，最终获得的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；将核苷酸序列SEQIDNo.5连接载体pUC57上，获得合成质粒swine-A12-pUC57；（c）利用NcoI、NotI对合成质粒swine-A12-pUC57进行双酶切，回收目的片段，利用T4DNA连接酶将回收的目片段接到pIT2载体上，次日将连接产物转入TG1化学转化感受态细胞中，然后将转化菌涂布于TYE-AG平板，37℃培养过夜；次日随机挑取单克隆菌落至1mL2×TY-A培养基中，于37°C，250rpm摇床过夜培养，获得swine-A12-pIT2菌液；（d）以SEQIDNo.6和SEQIDNo.7为引物，以swine-A12-pIT2菌液为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳，所获得的941bp的单一条带，即为所述猪源化改型抗体。进一步，如本专利技术所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体的制备方法，步骤（d）所述PCR扩增是指：PCR扩增体系为：2×PCRPremix10μl、10μM的引物各1μl、swine-A12-pIT2菌液2μl、ddH2O补足至20μl；PCR扩增条件：94℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保持；一种含如本专利技术所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体核苷酸序列的原核载体。一种如本专利技术所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体在农业虫害防治中的应用。一种本专利技术所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体的基因材料。本专利技术通过生物信息学预测猪源化抗体重、轻链可变区的8个FR，并植入抗独特型单链抗体A12的6个CDR来确定猪源化改型抗体的列，进行人工合成，从而构建A12的猪源化的改型抗体swine-A12-pUC57，并通过更换易于噬菌体表达的pIT2载体，获得与小菜蛾中肠BBMV具有结合活性的猪源化改型抗体swine-A12-pIT2，与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：（1）本专利技术利用生物信息学预测和人工合成的方法可快速高效的获得动物来源的改型抗体，获得多种动物来源的杀虫蛋白资源，使用这些基因工程抗体技术探索开发新型且安全性高的杀虫蛋白资源的可能性，也为发展新型杀虫白提供了新的思路和方向。（2）本专利技术获得的猪源化改型抗体swine-A12-pIT2可变区的FR属于猪源，而CDR属于人源，也可称为人-猪嵌合抗体，因此将swine-A12-p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有杀虫活性的猪源化改型抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
1.一种具有杀虫活性的猪源化改型抗体，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
2.如权利要求1所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（a）由GenBank筛选猪源抗体，并分别对其VH和VL进行氨基酸序列比对分析，确定保守序列，再根据IMGT鉴定方法分别确定VH和VL的FR1、FR2、FR3和FR4；
其中，VH和VL序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；
（b）将人源化抗独特型单链抗体A12的6个CDR植入猪源抗体的相对应部分，再加上连接重、轻链的(GGGGS)3Linker，即获得猪源抗体，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；
反向翻译所述猪源抗体氨基酸序列，并且在获得的核苷酸序列两端加上NcoI、NotI酶切位点及对应的碱基保护核酸序列，最终获得的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；将核苷酸序列SEQIDNo.5连接载体pUC57上，获得合成质粒swine-A12-pUC57；
（c）利用NcoI、NotI对合成质粒swine-A12-pUC57进行双酶切，回收目的片段，利用T4DNA连接酶将回收的目片段接到pIT2载体上，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘贤金，仲建锋，张霄，刘媛，何鑫，胡晓丹，武爱华，徐重新，谢雅晶，梁晓，林曼曼，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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