微藻生物质蛋白质富集方法技术

本发明专利技术涉及一种在异养条件下生长的微藻的蛋白质富集的方法，所述微藻是小球藻属，该方法特征在于该异养培养包含旨在借助发酵培养基中非氮营养源的缺乏来限制所述微藻生长的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 本专利技术涉及一种微藻生物质的蛋白质富集的方法，所述微藻更具体地是小球藻 属（Chlorella)，甚至更具体地是耐热性小球藻（Chlorella sorokiniana)或原壳小球藻 (Chlorella protothecoides)物种。 藻类一大型藻和微藻一具有特殊但大多未经开发的丰富性。它们在食物、化学品 和生物能源生产中的应用仍极少。然而，它们隐藏着具有巨大价值的组分，只有以其为食的 海洋动物才能真正了解这些组分的丰富性和丰度。 事实上，微藻是维生素、脂质、蛋白质、糖、色素和抗氧化剂的来源。 因此，藻类和微藻受到使用它们来生产膳食补充剂、功能性食物、化妆品或药物或 进行水产养殖的工业的关注。 最重要的是，微藻是定殖于所有曝露于光的群落生境的光合微生物。 在工业规模上，其单克隆培养是在光生物反应器（自养条件：具有光和C02)中进 行，或者对于一些微藻，也是在发酵罐（异养条件：在黑暗中在一种碳源存在下）中进行。 事实上，少数微藻物种能在无光下生长：小球藻属、菱形藻属（Nitzschia)、小环 藻属（Cyclotella)、四爿藻属（Tetraselmis)、隐甲藻属（Crypthecodinium)、裂壶藻属 (Schizochytrium)〇 此外，据估计在异养条件下培养的成本是在光养条件下培养成本的1/10,这是因 为对于技术人员来说，异养条件使得以下各项成为可能： -使用与用于细菌和酵母的发酵罐相同并且容许控制所有培养参数的发酵罐。 -所产生生物质的量显著大于基于光的培养所获得的量。 善用微藻一般需要控制发酵条件以积累所关注组分，例如： -色素（叶绿素a、b和c、e-胡萝卜素、虾青素、叶黄素、藻蓝蛋白、黄叶素、藻红 蛋白等），其需求因其显著的抗氧化性质以及在食物中提供天然色彩而日益增加， -蛋白质，以优化微藻的营养质量；或 -脂质，以优化微藻的脂肪酸含量（以其干物质重量计高达60%，甚至80% )，尤 其用于： ?生物燃料应用，以及 ?人类或动物食物应用（当所选微藻产生所谓的"必需"（即，因人类或动物无法 天然产生而在膳食中提供）多不饱和脂肪酸或PUFA时）。 因此，为获得这种结果，充分研究了第一种高细胞密度（HCD)发酵方法，以获得蛋 白质或脂质的最大产率和产量。 这些HCD培养的目标是在最短时间内以尽可能最高的浓度获得所需产物。 例如，针对祖芬氏小球藻（Chlorella zofingiensis)的奸青素的生物合成来验 证这个方案，其中证实这些微藻的生长与这种化合物的产生直接相关（王（Wang)和彭 (Peng)，2008,世界微生物学与生物技术杂志（World J Microbiol. Biotechnol.)，24 (9)， 1915-1922)。 然而，维持其生长处于最大速率（y，以h 1计）的事实与所需产物的高产量并非 始终相关。 事实上，业内专家很快就了解到，为了让微藻产生大储量的脂质，需要例如使这些 微藻经受限制其生长的营养压力。 现在，在发酵方法中解除了生长与产量的关系。 例如，为促进多不饱和脂肪酸（本文中为二十二碳六烯酸或DHEA)的积累，专利申 请W0 01/54510建议解除细胞生长与多不饱和脂肪酸产生之间的关联。 因此，在微藻裂壶藻属株系ATCC 20888中，在没有氧限制下进行第一生长期，以 促进高细胞密度（大于l〇〇g/l)的产生；然后，在第二步骤中，供氧逐步减少，以对这些微藻 施加压力，从而减慢其生长并起始所关注的脂肪酸的产生。 在微藻寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii)中，以低葡萄糖浓度（约5g/l) 且因此具有低生长速率来获得最高二十二碳六烯酸（DHEA，多不饱和脂肪酸）含量，（江 (Jiang)和陈（Chen)，2000,生物化学工艺（Process Biochem. )，35 (10)，1205-1209)。 这些结果明确说明，产物形成的动力学可与微藻生长呈正相关或负相关，甚至呈 二者的组合。 因此，在产物形成与高细胞生长无关的情形中，控制细胞生长速率是明智的。 -般来说，技术人员选择通过控制发酵条件（Tp、pH等）或通过控制营养组分向发 酵培养基的供应（半连续，所谓的"分批给料"条件）来控制微藻生长。 如果技术人员选择在异养条件下借助碳源供应来控制微藻生长，那么他/她一般 选择根据所产生的代谢物（例如，DHEA型多不饱和脂肪酸）调整给予微藻（寇氏隐甲藻、 纤细裸藻（Euglena gracilis)等）的碳源（纯葡萄糖、乙酸盐、乙醇等）。 温度也可以是一个关键参数： _例如，已报道，某些微藻物种的多不饱和脂肪酸合成，例如极微小球藻 (Chlorella minutissima)的EPA合成，在低于所述微藻的最佳生长所需温度的温度下被 促进； -相反，异养生长的原壳小球藻的叶黄素产率在生产温度从24°C升高到35°C时较 尚。 原壳小球藻无可非议地被公认为最佳产油微藻之一。 在异养条件下，其将碳水化合物快速转变为甘油三酯（大于其干物质的50%)。 为了优化这种甘油三酯生产，技术人员通过作用于发酵培养基的营养环境来优化 朝向油产生的碳通量。 由此得知，在供应足量碳，但在无氮条件下时，油积累。 因此，此处C/N比率是决定性的，并且已确认，最佳结果是在不限制葡萄糖含量 时，直接作用于氮含量来获得。 不出所料，这种氮缺乏影响细胞生长，导致生长速率比正常微藻生长速率降低 3〇% (熊（Xiong)等人，植物生理学（Plant Physiology)，2〇10，154,第 1001-1011 页）。 为了解释这个结果，熊等人在上文所提到的文章中显示，事实上，如果将小球藻 生物质分为五种主要组分，也就是碳水化合物、脂质、蛋白质、DNA和RNA(占其干物质的 85% )，如果C/N比率对DNA、RNA和碳水化合物含量无影响，那么蛋白质和脂质含量变得突 出。 因此，以低C/N比率生长的小球藻细胞含有25. 8 %的蛋白质和25. 23 %的脂质，而 高C/N比率使得能合成53. 8%的脂质和10. 5%的蛋白质。 因此为了优化油产生，技术人员必须通过将碳通量转向油产生来控制碳通量，以 降低蛋白质产生；在将这些微藻置于无氮培养基中时，该碳通量被重新分配并在脂质储存 物质中积累。 根据这个教导，为产生富含蛋白质的生物质，技术人员实施与此相反的代谢控制， 也就是应用代之以促进低C/N比率的发酵条件，并且因此： ~-向发酵培养基供应大量氮源，同时使将转化为蛋白质的碳源的载荷维持恒 定；并且 ~-刺激这些微藻生长。 这就是将碳通量修改为朝向蛋白质产生（且因此朝向生物质产生），以减少储存 脂质的产生。 在本专利技术背景下，申请人公司选择通过披露技术人员的传统设想的一个替代性解 决方案来探索一条新路径。 因此，本专利技术涉及一种异养生长的微藻的蛋白质富集的方法，所述微藻属于小球 藻属，更具体地为耐热性小球藻或原壳小球藻，所述异养培养方法包含旨在借助发酵培养 基中非氮营养源的缺乏来限制所述微藻生长的步骤。 这个步骤是一个异养培养步骤，其中在培养基中以不足以容许微藻生长的量供应 非氮营养因子。应注意，"不足……的量"并不意味着不供应这种营本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异养生长的微藻的蛋白质富集的方法，所述微藻是小球藻(Chlorella)属，该方法特征在于该异养培养包含旨在借助发酵培养基中非氮营养源的缺乏来限制所述微藻生长的步骤，由此使得生物质蛋白质含量可能达到大于50重量％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：加布里埃·马卡尔，西尔万·德拉罗什，马里·勒吕耶，劳伦特·塞盖拉，
申请(专利权)人：罗盖特兄弟公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR