本发明专利技术提供一种利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过Trizol溶液裂解植物细胞，利用硅基质膜吸附柱去除掉mRNA后用玻璃纤维滤膜吸附柱特异性吸附Micro RNA。同时利用去蛋白液和漂洗液洗去杂质。常规的植物MicroRNA提取方法主要是通过从凝胶中切下Micro RNA片段，对其进行提取与纯化，耗时需要20h以上，同时长时间的操作容易造成Micro RNA的降解，与常规的植物MicroRNA提取方法相比，本方法仅需要1h左右即可以提取到植物micro RNA，可以节省大量的提取时间。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供，属于生物
技术背景MicroRNA是由内源基因编码、长度约21~25nt的一类非编码单链RNA分子，其主 要功能是参与动植物转录后的基因表达与调控。大多数miRNA基因存在于基因组中的形式 包括3种：单拷贝、多拷贝和基因簇。虽然植物miRNA的发现和识别相比动物的时间要短， 但对植物miRNA的研究已成为中外科研工作者解析基因表达调控过程的重要研究内容。MicroRNA是一种古老的基因调控机制，在进化过程中表现出非常高的结构保守 性。植物MicroRNA具有和动物MicroRNA共同的一些特征。如：长度一般是21-25nt的RNA; 前体均是具有发夹结构的单链RNA;成熟后不具有编码蛋白质的能力；成熟的MicroRNA3' 端为羟基，5'端是磷酸基团等。与动物MicroRNA相比，植物MicroRNA还具有以下几点特 征：①植物MicroRNA前体相比动物MicroRNA前体长度变异明显；②植物MicroRNA成熟的 时候才体现进化上的保守性，动物MicroRNA不论是前体还是成熟的MicroRNA保守性均较 高；③植物MicroRNA5'端更倾向于与尿嘧啶结合；④植物MicroRNA与靶mRNA基本上完 全互补对，并可与任何蛋白编码区作用；⑤植物MicroRNA进化保守性较高，其靶标主要是 控制植物生长发育的转录调控因子等植物中MicroRNA作用及其作用机制是植物生物学研 究领域中的一个热点。近年来，虽然在MicroRNA研究方面已取得了突破性进展，但对其功 能及具体机理的研究还有待深入研究。然而对植物MicroRNA的相关研究的前提都是提取 植物MicroRNA，常规的植物MicroRNA采用PAGE胶回收法，其流程较为繁琐，且操作难度较 大。因此，提供一种快速、简便地提取植物MicroRNA显得非常重要。
技术实现思路
： 本专利技术提供，利用该方法能够节省大量操 作时间，便于更快速地提取到植物MicroRNA。 -种利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，包括植物组织的破碎、MicroRNA的吸 附以及杂质的去除。其具体步骤如下： 植物组织的破碎：称取0. 2-lg植物样品加入液氮研磨成粉状，将其迅速转入1. 5ml离 心管，加入〇? 5-lmlTrizol裂解液，振荡器震荡30-60s后，加入100-300ul的BufferA，振 荡器震荡30-60s。MicroRNA的吸附以及杂质的去除：将样品10000-13000rpm/min离心10min，离 心后将上清吸到1.5ml离心管。加入等体积的BufferB，混勾后将样品加到RNase-free 吸附柱RA，10000-13000rpm/min离心lmin，收集液体到新的1. 5ml离心管，加入等体积的 BufferC混勾后将样品加到RNase-free吸附柱RB。倒掉液体，加入200-600ul去蛋白液， 10000-13000rpm/min离心l_5min，倒掉液体，加入 200_600ul漂洗液，2000-12000rpm/min 离心l_5min，倒掉液体，加入200_600ul漂洗液，10000-13000rpm/min离心l_5min，倒掉液 体，吹干后加入30-60ulDEPC水，10000-13000rpm/min离心l-5min，收集液体。 所述的Trizol提取液 所述的BufferA溶液：氯仿 所述的BufferB溶液：70-80%乙醇 所述的BufferC溶液：无水乙醇 所述的去蛋白液溶液：3-8M盐酸胍，10-30mM三羟甲基氨基甲烷，pH6-7,30-40%乙醇 所述的漂洗液溶液：10_30mM氯化钠，l_5mM三羟甲基氨基甲烷，pH7-8，70-90 %乙醇 所述的RNase-free吸附柱RA为硅基质膜吸附柱。购自康为世纪生物科技有限公司 所述的RNase-free吸附柱RB为玻璃纤维滤膜吸附柱。购自康为世纪生物科技有限公 司 本专利技术通过Trizol溶液裂解植物细胞，利用硅基质膜吸附柱去除掉mRNA后用玻璃纤 维滤膜吸附柱特异性吸附MicroRNA。同时利用去蛋白液和漂洗液洗去杂质。常规的植物 MicroRNA提取方法主要是通过从凝胶中切下MicroRNA片段，对其进行提取与纯化，耗时 需要20h以上，同时长时间的操作容易造成MicroRNA的降解，与常规的植物MicroRNA提 取方法相比，本方法仅需要lh左右即可以提取到植物microRNA，可以节省大量的提取时 间。【附图说明】 图1为利用本方法提取的植物MicroRNA电泳结果图。 具体实施例： 图1中，泳道1，2, 3分别是水稻、花生、甘蔗的MicroRNA电泳结果图，泳道4为DNA marker〇 本专利技术的，具体步骤如下 植物组织的破碎：分别称取0. 5g的水稻、花生、甘蔗样品加入液氮研磨成粉状，将其迅 速转入1. 5ml离心管，加入lmlTrizol裂解液，振荡器震荡30s后，加入200ul的Buffer A，振荡器震荡30s。 MicroRNA的吸附以及杂质的去除：将样品12000rpm/min离心10min，离心后将上 清吸到1. 5ml离心管。加入等体积的BufferB，混匀后将样品加到RNase-free吸附柱RA， 12000rpm/min离心lmin，收集液体到新的1. 5ml离心管，加入等体积的BufferC混勾后 将样品加到RNase-free吸附柱RB。倒掉液体，加入500ul去蛋白液，12000rpm/min离心 lmin，倒掉液体，加入500ul漂洗液，2000rpm/min离心lmin，倒掉液体，加入500ul漂洗液， 12000rpm/min离心lmin，倒掉液体，吹干后加入 50ulDEPC水，12000rpm/min离心 2min， 收集液体。 下表为植物MicroRNA的 0D(260:280)值。 Trizol提取液〇 BufferA溶液：氯仿。 BufferB溶液：70% 乙醇。 BufferC溶液：无水乙醇。 去蛋白液溶液：51盐酸胍，20禮三羟甲基氨基甲烷4册.6,38%乙醇。 漂洗液溶液：20禮氯化钠，21111三羟甲基氨基甲烷4117.5,80%乙醇。 RNase-free吸附柱RA为硅基质膜吸附柱。购自康为世纪生物科技有限公司。 RNase-free吸附柱RB为玻璃纤维滤膜吸附柱。购自康为世纪生物科技有限公司。 利用本方法提取的植物MicroRNA结果见图1，泳道1，2, 3分别是水稻、花生、甘蔗 的MicroRNA电泳结果图，泳道4为DNAmarker。从图1可看出本方法可以提取到完整性较 好的植物MicroRNA。纯度的检测结果见表1，植物MicroRNA样品的0D(260:280)比值均在 1. 91-1. 93之间，说明本方法提取的植物MicroRNA具有较高的纯度。【主权项】1. ，包括植物组织的破碎、MicroRNA的吸附 以及杂质的去除，其特征是： 植物组织的破碎：称取0. 2-lg植物样品加入液氮研磨成粉状，将其迅速转入I. 5ml离 心管，加入〇? 5-lml Trizol裂解液，振荡器震荡30-60s后，加入100-300ul的Bu本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，包括植物组织的破碎、MicroRNA的吸附以及杂质的去除，其特征是：植物组织的破碎：称取0.2‑1g植物样品加入液氮研磨成粉状，将其迅速转入1.5ml离心管，加入0.5‑1ml Trizol裂解液，振荡器震荡30‑60s后，加入100‑300ul的Buffer A，振荡器震荡30‑60s；MicroRNA的吸附以及杂质的去除：将样品10000‑13000rpm/min离心10min，离心后将上清吸到1.5ml离心管，加入等体积的Buffer B，混匀后将样品加到RNase‑free吸附柱 RA，10000 ‑13000rpm/min离心1min，收集液体到新的1.5ml离心管，加入等体积的Buffer C混匀后将样品加到RNase‑free吸附柱 RB；倒掉液体，加入200‑600ul去蛋白液，10000‑13000rpm/min离心1‑5min；倒掉液体，加入200‑600ul 漂洗液，2000‑12000rpm/min离心1‑5min；倒掉液体，加入200‑600ul 漂洗液，10000‑13000rpm/min离心1‑5min；倒掉液体，吹干后加入30‑60ul DEPC水，10000‑13000 rpm/min离心1‑5min，收集液体。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王清水，余彦，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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