用于抑制高表达FAK基因的肝细胞癌细胞的siRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于抑制高表达FAK基因的SMMC7721、QGY7701肝细胞癌细胞的siRNA，所述siRNA为如SEQ ID NO.9-10所示的RNA序列。本发明专利技术的siRNA能抑制人FAK基因表达，可应用于在制备抗肝癌肿瘤的药物中，为治疗或防治肝癌新药的开发提供新的途径。

【技术实现步骤摘要】
用于抑制高表达FAK基因的肝细胞癌细胞的siRNA及其应用该申请是以下专利申请的分案申请：申请号为201310084396.8，申请日为2013年3月15日，专利技术名称为“用于抗肿瘤的siRNA及其应用”。
本专利技术涉及一种siRNA及其应用，特别是涉及一种用于抑制高表达FAK基因的肝细胞癌细胞的siRNA及其应用。
技术介绍
粘附斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)是一类胞质非受体蛋白酪氨酸激酶，它在细胞信号转导中处于十分重要的位置，介导多条信号通路，可以调节细胞生长、并与胚胎发育、肿瘤发生与迁移有关。肿瘤细胞的侵袭性生长是一个多步骤的复杂过程，有多种生物化学因子参与其中。肿瘤细胞必须黏附于细胞外基质，通过促进依赖于PTK激酶活性的细胞外基质信号转导，进而影响细胞的黏附、运动与迁移。其中，FAK介导的信号转导系统是其中重要的细胞信号转导途径之一。RNA干扰(RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。因而，利用RNA干扰技术，并结合FAK的功能，为肿瘤的治疗提供良好的指导意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种用于抑制高表达FAK基因的肝细胞癌细胞的siRNA及其应用。通过利用RNA干扰技术，能有效抑制FAK基因的表达，因而，能更加有效地进行肿瘤治疗。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于抑制高表达FAK基因的SMMC7721、QGY7701肝细胞癌细胞的siRNA，所述siRNA为如SEQIDNO.9-10所示的RNA序列。另外，本专利技术还提供一种编码如上所述的siRNA的DNA序列。本专利技术还提供一种表达载体，所述表达载体包含有如上所述的siRNA的DNA序列。本专利技术又提供一种宿主细胞，所述宿主细胞是一种可表达如上所述的siRNA序列的细胞，如可包含有如上所述的表达载体。此外，本专利技术还提供一种如上所述的siRNA在制备抑制高表达FAK基因的SMMC7721、QGY7701肝细胞癌细胞的药物中的应用。此外，本专利技术还提供一种抑制高表达FAK基因的SMMC7721、QGY7701肝细胞癌细胞的药物，含有有效量的如上所述的siRNA和药学上可接受的载体。该药物可以采用常规方法制备成相应制剂，如可被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。针剂、溶液等宜在无菌条件下制造。该药物可以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、鼻内等给药途径。本专利技术药物的用量和疗程可根据剂型、患者的年龄、疾病的轻重程度作适当调整，即具体施用剂量取决于多种因素，如给药方式、用药者健康状况等因素，这些都是在熟练医师技能范围内。再者，本专利技术还提供一种药盒，含有如上所述的siRNA或含有如上所述的药物。该药盒可根据制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。本专利技术实验证明FAK基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，因此，FAK基因可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。同时，本专利技术的siRNA能抑制人FAK基因表达，减少肝癌细胞侵袭，因此，本专利技术的siRNA可应用于在制备抑制肝癌的药物中，为治疗或防治肝癌新药的开发提供新的途径。附图说明下面结合附图与具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明：图1是RT-PCR验证FAK基因在10例肝癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况示意图，其中，“N”指癌旁组织，“C”指肝癌组织；图2是荧光定量PCR检测FAK基因在95例肝癌病人中的表达情况图；图3是Panomics分析FAK基因在146例肝癌病人中的表达情况图；图4是siRNA转染SMMC7721细胞后的FAK表达图；图5是siRNA转染WRL68细胞后的FAK表达图；图6是siRNA转染QGY7701细胞后的FAK表达图；图7是siRNA转染SMMC7721细胞后的相对荧光值图；图8是siRNA转染WRL68细胞后的相对荧光值图；图9是siRNA转染QGY7701细胞后的相对荧光值图；图10是siRNA转染SMMC7721后的细胞划痕图。具体实施方式以下实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1FAK基因在肝癌组织中的表达1、组织分离实验用组织来源于原发性肝癌的手术病人。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，立即分装在冻存管内，放入液氮中(-80℃)保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。2、总RNA提取采用Trizol(Invitrogen公司)试剂，按照其说明书进行组织的总RNA提取。具体步骤如下：1)Homogenize匀浆：组织匀浆：每100mg组织加入1mlTRIzol试剂，并用匀浆器匀浆。2)加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1min左右，室温静置5min。3)4℃，12,000rpm离心15min。4)小心取出上清液，避免触及中间层，将上清夜转入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5min。5)4℃，12000rpm离心15min。6)吸去上清，保留沉淀，并向沉淀中加入1ml75％乙醇，4℃、12000rpm离心15min洗涤沉淀。7)吸去上清，沉淀室温自然晾干后加入适量RNase-free的水，用Tip头吹吸，充分溶解沉淀。8)取1-2μL，测定RNA浓度以及A260/A280值。一般A260/A280比值在1.8-2.1。RNA存放在-80℃冰箱待用。3、逆转录合成cDNA用PrimeScriptRTMasterMixPerfectRealTime(TAKARA公司)逆转录cDNA，反应体系(总量为10μl)如表1所示。表1反应体系反应条件如下：1)37℃15分钟；2)85℃5秒钟；3)4℃保存(-20℃长期保存)。4、RT-PCR采用相对定量法检测FAK基因在肝癌样本中的表达差。使用仪器：ThermalCyclerDiceTMRealTimeSystemTP800,Takara。模板：上述反转录产物按1:10比例稀释后作为PCR反应的模板。引物如表2所示：表2引物序列PCR反应的体系：PCR反应采用TAKARA公司的耐热性TaqDNA聚合酶(DR001)，以人基因组为模板时，能很好地扩增3.0kbp(p53基因)的DNA片段。其中，PCR反应的试剂及其用量如表3所示。表3PCR反应的试剂及其用量试剂使用量TakaraTaq(5U/μl)0.1μl10×PCR缓冲液(Mg2+Plus)2μldNTP混合物(每种2.5mM)1.6μl引物混合物(每个5μM)1.6μl模板0.5-4μlddH2O补至20μlPCR反应条件：目的基因：结果如图1所示，FAK基因在肝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于抑制高表达FAK基因的SMMC7721、QGY7701肝细胞癌细胞的siRNA，其特征在于，所述siRNA为如SEQ ID NO.9‑10所示的RNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于抑制高表达FAK基因的SMMC7721、QGY7701肝细胞癌细胞的siRNA，其特征在于，所述siRNA为如SEQIDNO.9-10所示的RNA序列。2.一种编码如权利要求1所述的siRNA的DNA序列。3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体包含权利要求2所述的DNA序列。4.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞是一种可表达如权利要求1所述的siRNA序列的细胞。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄健，
申请(专利权)人：黄健，
类型：发明
国别省市：上海;31