一种硅基阵列微反应池数字PCR芯片及其制备方法技术

本发明专利技术属于PCR技术领域，具体涉及一种硅基阵列微反应池数字PCR芯片及其制备方法。该芯片主要包括上盖和芯片，其中在芯片上有蜂窝状排列的微孔，上盖固定于芯片槽上。具体步骤为选择一单面抛光的硅片，清洗，在硅片抛光面上旋涂一层均匀的光刻胶，通过曝光形成圆形的图形阵列，在圆形的图形阵列掩膜下干法刻蚀硅，形成微孔结构，去胶划片，完成芯片制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于PCR
，具体涉及一种硅基阵列微反应池数字PCR芯片及其制备方法。
技术介绍
DNA分子扩增技术的应用促进了分子生物学技术的发展，精确定量DNA拷贝数是现代分子生物学和医学的重要应用之一。1997年，JamesF.Brown，JonathanE.Silver和OlgaV.Kalinina构建了数字PCR(digitalpolymerasechainreaction，dPCR)技术的雏形，并获得了美国专利(专利号：US6143496A)。与传统PCR技术不同的是，数字PCR将核酸样本充分稀释，使每个反应舱的样本模板数少于或者等于1个，PCR扩增结束后对各个反应舱的荧光信号进行统计学分析，解决了实时荧光定量PCR(realtimequantitativePCR，qPCR)利用对照标准样品和标准曲线进行相对定量过程中的一系列问题，实现了单分子DNA绝对定量。该技术灵敏度高、特异性强、检测通量高、定量准确，已经广泛应用于临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面。数字PCR(DigitalPCR-dPCR)技术是一种新的核酸检测和定量方法，与传统定量PCR(qPCR)技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统qPCR更加出色的灵敏度和特异性、精确性，dPCR迅速得到广泛的应用，这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面变现出的优势已被普遍认可，而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。数字PCR芯片可使用的反应池材料相当广泛。在选择数字PCR芯片材料时，需要综合考虑材料的多方面性质，包括导热性、耐用性、成本、表面化学性质、光学和电学性能、生物相容性，是否易于制造、集成及大规模生产等。目前已报道的数字PCR系统主要采用硅、玻璃、PDMS等构成。玻璃透明，但导热性较差。PDMS材料具有优良的生物惰性、较好的透光性，因此在数字芯片中得到了广泛的应用，但是在数字PCR芯片的应用中具有一定的局限性，主要是由于PDMS具有一定程度的透气性，而PCR的热循环温度较高，高温一般在94-95℃，同时在预变性过程中还需要在高温阶段维持5-10分钟，由于PCR热循环过程的高温已经接近水的沸点100℃，如果密封材料具有一定透气性势必会使水蒸气挥发造成反应液中水溶剂减少，反应液的成分浓度发生变化，当热循环温度降低时，由于反应池高温时水分的挥发形成负压，环境中的气体同样会由于PDMS的透气性进入到反应池中形成气泡，进而影响反应池的密封。同时PDMS的热导率较差(约0.18W/mK)，利用其制备的PCR芯片在热循环过程中热传递效率较低，如果在不延长热循环时间的前提下必然会对PCR扩增效率造成影响。现有技术存在着很多问题，比如，很难将液体均匀地进入到芯片上的阵列微孔中，在PCR反应过程中，液体容易蒸发，不同的区域面积受热不均。芯片上的微孔之间容易串扰。反应微孔的极性不能与反应体系相匹配，催化酶容易吸附在微孔壁上，不能参与反应。微流控芯片价格高昂。所以急需制造出一种功能全面，性能优越的数字PCR芯片。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是一种阵列微反应池数字PCR芯片，所述芯片12设置有列阵的微孔13，芯片12上方有上盖18。所述芯片12为硅片；所述芯片12的厚度为0.36-0.50mm，优选为0.38-0.39mm；所述上盖18为透明玻璃。所述微孔13为蜂窝状排列，微孔13直径为20-200微米，优选为50-200微米；微孔13的外围有沟槽11。所述芯片12放置于芯片槽1内，芯片槽1设置有凹槽10，导热板2的上端面上设置有0型密封圈3；在所述的导热板1的四角分别设置第一凸缘7和第二凸缘8，在每一第一凸缘7的上端面上分别设置一螺钉4，在每一第二凸缘8的上端面上分别设置一隔热衬套5；所述凹槽10的四边设置有台阶9；台阶9设置有弧形凹口6；凹槽10内注满油，所述油为低密度矿物油；所述导热板1的厚度为2.5-3.5mm，制作材料为紫铜；所述O型密封圈3的材料为耐热橡胶；所述螺钉4的材料为不锈钢；所述隔热衬套5的材料为聚四氟乙烯。所述芯片12的表面与微孔13内部进行了PEG修饰；使整个芯片表面及微孔内部形成一层或多层PEG；PEG修饰试剂为2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷。阵列微反应池数字PCR芯片制备方法，具体步骤如下：步骤1：选择一单面抛光的芯片基片；步骤2：清洗，(1)丙酮水浴10min，超声10min，回收废液，去离子水冲洗20遍以上；(2)乙醇水浴10min，超声10min，回收废液，去离子水冲洗2()遍以上；(3)配制硫酸过氧化氢混合溶液，H2SO4和H2O2的体积比为3∶1，使用热板18()℃加热20min，回收废液后用去离子水冲洗2()遍以上；(4)吹片烘干；步骤3：在芯片基片抛光面上旋涂一层均匀的光刻胶，通过曝光在表面形成圆形的图形列阵；步骤4：在图形阵列掩膜下干法刻蚀芯片12，形成沟槽11和圆形的微孔13；步骤5：去胶，丙酮水浴10min，超声10min，以硫酸过氧化氢混合溶液浸泡20min，大量去离子水冲洗20遍以上；步骤6：划片，完成芯片12制备。所述步骤还包括对芯片12的表面与微孔13内部进行PEG修饰；向微孔13内进液采用刮液方式，将PCR反应液加到芯片的一侧，倾斜、缓慢刮液；刮液过程持续10s；刮液结束后，沿刮液方向滴加油滴，直至整个芯片12被油覆盖；滴油过程持续5-10s；所述刮液使用硅胶片。所述步骤还包括将芯片槽1注满油，然后将芯片12放置入凹槽10，利用芯片12槽1内的台阶9支撑芯片12，然后加上盖18，利用螺钉4将上盖18固定于芯片槽1上，整个过程避免产生气泡。本专利技术采用刮液方式进液，最后利用油封实现了孔与孔之间无串扰，孔内试剂独立密封的目的。在微孔中进液，通过油和上盖再将芯片整体密封，有效避免了将微泵、微阀等进液装置集成到芯片外围加工工艺复杂，价格昂贵的问题。密封后的芯片保证了内部的油及芯片与外部环境的隔液隔气。芯片槽材料采用紫铜加工而成，能够快速的进行热量传递，有效缩...

【技术保护点】
一种阵列微反应池数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片(12)设置有列阵的微孔(13)，芯片(12)上方有上盖(18)。

【技术特征摘要】
1.一种阵列微反应池数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片(12)设
置有列阵的微孔(13)，芯片(12)上方有上盖(18)。
2.如权利要求1所述的阵列微反应池数字PCR芯片，其特征在于，
所述芯片(12)为硅片；芯片(12)的厚度为0.36-0.50mm；所述上盖(18)为
透明石英玻璃。
3.如权利要求1所述的阵列微反应池数字PCR芯片，其特征在于，
所述微孔(13)为蜂窝状排列，微孔(13)直径为20-200微米，微孔(13)的
外围有沟槽(11)。
4.如权利要求1所述的阵列微反应池数字PCR芯片，其特征在于，
所述芯片(12)放置于芯片槽(1)内，芯片槽(1)设置有凹槽(10)，导热板(2)
的上端面上设置有O型密封圈(3)；在所述的导热板(1)的四角分别设置第
一凸缘(7)和第二凸缘(8)，在每一第一凸缘(7)的上端面上分别设置一螺
钉(4)，在每一第二凸缘(8)的上端面上分别设置一隔热衬套(5)；
所述凹槽(10)的四边设置有台阶(9)；台阶(9)设置有弧形凹口(6)；
凹槽(10)内注满油，所述油为低密度矿物油；所述导热板(1)的厚度为
2.5-3.5mm，制作材料为紫铜；所述O型密封圈(3)的材料为耐热橡胶；所
述螺钉(4)的材料为不锈钢；所述隔热衬套(5)的材料为聚四氟乙烯。
5.如权利要求1所述的阵列微反应池数字PCR芯片，其特征在于，
所述芯片(12)的表面与微孔(13)内部进行了PEG修饰；使整个芯片表面及
微孔内部形成一层或多层PEG；PEG修饰试剂为2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]
三甲氧基硅烷。
6.如权利要求1所述的阵列微反应池数字PCR芯片制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞育德，魏清泉，刘勇，李钊，孙英男，刘文文，蒋莉娟，
申请(专利权)人：中国科学院半导体研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11