本发明专利技术公开了一种检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的可视化基因芯片和试剂盒。本发明专利技术特定方法制备的可视化基因芯片，可以用肉眼直观地看到检测结果，不需要价格昂贵的激光共聚扫描仪，成本低廉，同时，灵敏度较高，与现有荧光标记方法的灵敏度相当，特异性强，耗时短，检测快速，临床应用前景良好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病 毒的可视化基因芯片以及试剂盒。
技术介绍
多病原混合感染是当前猪场疫病的普遍现象，猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪流行 性乙型脑炎这三种猪病毒引起的疾病症状相似且常常呈混合感染，是当前危害养猪业的3 种重要病毒性疾病，因此早期鉴别诊断并及时了解流行状况对控制这3种病的流行显得尤 其重要。目前对这3种病的诊断多采用病原的分离及常规的血清学方法，但需时间较长。最 近国外和国内均建立了病原的分离鉴定、免疫胶体金技术、酶联免疫吸附试验、血清中和实 验、聚合酶链反应等，但是还不能更加快速的检测多种病原的混合感染。 基因芯片技术是近年来新兴起的一种生物高新技术，该技术可以同时定量或定性 的检测成千上万个基因信息，具有无选择性、客观、高通量的特点。基因芯片计划开展后， 许多部门、大学、重点实验室及制药公司参与了该项目的研发，我国相继也成立了一大批 基因芯片公司。随着基因组数据的增长以及分子生物学相关学科的快速发展，基因芯片技 术得到迅猛发展和广泛应用。但生物芯片技术发展时间较短，很多技术还处于初级研发阶 段，要成为实验室研究或临床可以普遍采用的技术仍有诸多关键问题亟待解决。（1)基因芯 片的特异性的提高；（2)增加信号检测的灵敏度；(3)简化样品制备和标记操作；(4)设备 与操作人员的要求较高；（5)应用标准的统一。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种新的特异性强、灵敏度高的可同时检测猪 流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的可视化基因芯片和试剂盒。 本专利技术检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的可视 化基因芯片，其特征在于：它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括 SEQ ID N0:1所示寡核苷酸片段，SEQ ID N0:2所示寡核苷酸片段，以及SEQ ID N0:3所示 寡核苷酸片段，用于检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。 其中，所述基因芯片按照如下方法制备： (1)制备探针溶液：取探针，用点样缓冲液将探针稀释至200ng/ul，得探针溶液； ⑵采用微喷头喷点方式，在压力为lOKPa的情况下，将探针溶液点样于氨基玻片 上，重复两次，即可。 微喷头喷点方式：通过微喷头将样品点到基片上的方式。 其中，它还包括定位探针，定位探针是SEQ ID N0 :4所示的基因片段。 本专利技术还提供了制备前述可视化基因芯片的方法，其特征在于：步骤如下： (1)制备探针溶液：取探针，用稀释至200ng/ul，得探针溶液； ⑵采用微喷头喷点方式，在压力为lOKPa的情况下，将探针溶液点样于氨基玻片 上，重复两次，即可。 本专利技术检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂 盒，其特征在于：它包括前述的可视化基因芯片、扩增试剂以及显色试剂； 其中，扩增试剂包括SEQ ID N0 :5~6、7~8、9~10所示引物对，用于分别扩增 猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒基因； 显色试剂包括金标链霉亲和素以及银染试剂。 其中，所述扩增试剂还包括SEQ ID N0 :11~12所示引物对。 所述金标链霉亲和素是Nanogold-Streptavidin稀释10~40倍后的溶液。优选 地，所述金标链霉亲和素的是Nanogold-Streptavidin稀释40倍后的溶液。 本专利技术特定方法制备的可视化基因芯片能够准确检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪 瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，可以用肉眼直观地看到检测结果，不需要价格昂贵的 激光共聚扫描仪，成本低廉，同时，灵敏度较高，与现有荧光标记方法的灵敏度相当，特异性 强，耗时短，检测快速，临床应用前景良好。 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本专利技术的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本专利技术权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。【附图说明】 图1点样仪的位置标定 图2点样仪的喷样参数 图3因芯片阵列点样模式图 图4基因芯片点制的基本参数设置。A:玻片设置B:点阵设置C:阵列设置D: 清洗设置E:样品设置 图5A质粒菌的复苏与鉴定结果。M:100bp DNA Ladder ;1 :Y11基因；2 :JEV基因； 3 :PS8 基因；B 阳性质控鉴定结果。M: 100bp DNA Ladder ;1 : ADNA 图6基因芯片的有效性检测结果。A :阳性质控单独杂交结果；B :全部探针杂交结 果 图7基因芯片的特异性检测结果 A:监耳病毒质粒杂父结果；B:乙脑病毒质粒杂父结果；C:猪痕病毒质粒杂父结果 图8基因芯片灵敏性检测结果 图9基因芯片的稳定性检测结果 图10点样缓冲液的选择结果。A:无菌超纯水；B:3XSSC ;C:博奥点样缓冲液 图11点样次数的优化结果图12基因芯片杂交温度的优化结果 图13杂交时间的优化结果 图14 Nanogold-Streptavidin稀释倍数的优化结果 图15银染时间的优化结果 图16临床检测结果【具体实施方式】 一、实验材料和仪器 1. 1生物材料 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)毒株、猪瘟病毒（CSFV)毒株和猪流行性乙型脑 炎病毒（JEV)毒株，购自中国兽药监察所。 1. 2主要试剂 氨基基片：過氨基载玻片，购自上海百傲生物科技股份有限公司；点样缓冲 液：Baio?点样缓冲液，购自上海百傲生物科技股份有限公司，晶芯芯片点样液，购自北京博 奥生物有限公司；杂交缓冲液：Bai〇?杂交缓冲液，购自上海百傲生物科技股份有限公司； 银染试剂：Silver buffer A，Silver buffer B，购自美国Sigma公司；金标链霉亲和素： Nanogold-Streptavidin，购自美国Nanogold公司；阳性质控（A DNA)为宝生物工程（大 连）有限公司产品；小量质粒抽提试剂盒购自Omega公司。 1. 3主要仪器设备 空气恒温摇床，美国Thermo公司；AllegraTM64R高速冷冻离心机，美国Thermo公 司；POWER PacTM电泳仪及水平电泳槽，美国BI0-RAD公司；UNIVERSAL H00D凝胶成像系 统，美国 BI0-RAD 公司；MyCyclerTMPCR 仪，美国 BI0-RAD 公司；SmartSpecTMPlus 核酸蛋白 仪，美国BI0-RAD公司；超纯水仪，Milli Qplus，法国产；梯度PCR仪，美国BI0-RAD公司； 分子杂交仪，美国Thermo公司；晶芯? SmartArrayer?16,微阵列芯片点样系统：Capitalbio Corporation，北京博奥生物公司；晶芯? LuxScan?10K微阵列芯片扫描仪：Capitalbio Corporation，北京博奥生物有限公司；多样品围栏、多样品围栏粘贴工具、多样品围栏盖 片，芯片杂交盒均为北京博奥生物有限公司。 实施例1本专利技术可视化基因芯片的制备及用其检测的方法 1、材料和仪器 同前述实验材料和仪器。 2本专利技术基因芯片的制备及性能检测 2.1引物与探针的制备本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的可视化基因芯片，其特征在于：它包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1所示寡核苷酸片段，SEQ ID NO：2所示寡核苷酸片段，以及SEQ ID NO：3所示寡核苷酸片段，用于分别检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述基因芯片按照如下方法制备：(1)制备探针溶液：取探针，用稀释至200ng/ul，得探针溶液；(2)采用微喷头喷点方式，在压力为10KPa的情况下，将探针溶液点样于氨基玻片上，重复两次，即可。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：文心田，黄小波，张仙，曹三杰，文翼平，伍锐，常晓霞，马锐，杨国淋，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。