一种细胞生产(S)-氯苯丙酸甲酯的方法技术

一种近平滑假丝酵母细胞生物催化制备 (S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯的方法，反应罐中加入磷酸盐缓冲液，用近平滑假丝酵母细胞进行生物催化反应，产品收率高，对映体过量率高，解决了现有方法生产的困难。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于制药工程
，特别涉及到近平滑假丝酵母细胞生物催化制备手性医药中间体(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯的技术。
技术介绍
手性(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯具有很好的应用前景。生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺陷，难于进行工业化生产。本专利技术将采用生物细胞催化制备(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯。
技术实现思路
本专利技术采用近平滑假丝酵母细胞催化制备(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应式如下：底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯（1）经近平滑假丝酵母催化反应，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯（2）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用近平滑假丝酵母作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。许多近平滑假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本专利技术选用近平滑假丝酵母菌株为ATCC20008，其催化反应效果最佳。由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型,而细胞本身所含有的辅酶量可能较少,因此,进行氧化还原反应时,为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同，效果差别很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳的辅助底物。本专利技术经过大量实验确定的辅助底物为：木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、异丙醇5-6%V/V(体积浓度)。由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。培养介质：1、种子培养基成份为:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6.8;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。2、培养液成份：葡萄糖37-44g/L,木糖7-8g/L，玉米胚芽粉10-12g/L，酵母提取物4-5g/L,(NH4)2HPO412-15g/L,KH2PO46.5-7.5g/L.MgSO4.7H2O0.7-0.8g/L,NaCl0.08-0.1g/L;pH6.8。2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。酵母细胞制备。近平滑假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至29-30℃，将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为0.5-0.7V/（V分钟），29-30℃培养44-48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。生物催化转化。底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.6，加入底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯，使底物浓度为80-90g/L。其他成份：麦芽浸膏22-26g，平平加O（PerogolO,15个单位的氧乙烯与油醇的缩合物)19-20g/L，木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、异丙醇5-6%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至24-25℃时，加入湿酵母细胞使浓度为89-92g/L，通气比为0.15-0.16V/（V分钟），即每分钟通气量为0.15-0.16倍反应液体积，进行生物催化反应，反应时间为78-82小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率98-99％，产品收率96-97％，对映体过量率98.5-99％。本专利技术所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化（反应温度、通气量、pH）、反应介质选择和浓度优化，包括底物浓度、麦芽浸膏含量、辅助底物组合、表面活性剂种类及浓度等。实施例1种子培养基成份为:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6.8;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。培养液成份为：葡萄糖37g/L,木糖78g/L，玉米胚芽粉10g/L，酵母提取物4g/L,(NH4)2HPO412g/L,KH2PO46.5g/L.MgSO4.7H2O0.7g/L,NaCl0.08g/L;pH6.8。湿酵母细胞制备过程如下：近平滑假丝酵母ATCC20008经斜面、摇瓶培养，得到种子液。1L发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至29℃，将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6％，通气比为0.5V/（V分钟），29℃培养44小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。生物催化转化：0.5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.6，加入底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯，使浓度为80g/L，麦芽浸膏22g，平平加O（PerogolO,15个单位的氧乙烯与油醇的缩合物)19g/L，木糖45g/L、蔗糖28g/L、异丙醇6%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至29℃时，加入湿酵母细胞使浓度为89g/L，通气比为0.15V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为78小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率99％，产品收率97％，对映体过量率98.5％。实施例2种子培养基成份为:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6.8;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。培养液成份为：葡萄糖44g/L,木糖8g/L，玉米胚芽粉12g/L，酵母提取物5g/L,(NH4)2HPO415g/L,KH2PO47.5g/L.MgSO4.7H2O0.8g/L,本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种近平滑假丝酵母细胞生物催化制备 (S)‑3‑(4‑氯苯基)‑3‑羟基丙酸甲酯的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液， pH为6.6，加入底物4‑氯苯甲酰乙酸甲酯，使底物4‑氯苯甲酰乙酸甲酯添加量为80‑90 g/L，麦芽浸膏22‑26 g，平平加O 19‑20g/L，木糖45‑50g/L、蔗糖25‑28g/L、异丙醇5‑6%V/V，121℃高压灭菌30分钟；冷却至29‑30℃时，加入湿酵母细胞使浓度为89‑92g/L，通气比为0.15‑0.16V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为78‑82小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物 (S)‑3‑(4‑氯苯基)‑3‑羟基丙酸甲酯，反应转化率98‑99％，产品收率96‑97％，对映体过量率98.5‑99％。

【技术特征摘要】
1.一种近平滑假丝酵母细胞生物催化制备(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.6，加入底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯，使底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯添加量为80-90g/L，麦芽浸膏22-26g，平平加O19-20g/L，木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、异丙醇5-6%V/V，121℃高压灭菌30分钟；冷却至29-30℃时，加入湿酵母细胞使浓度为89-92g/L，通气比为0.15-0.16V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为78-82小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率98-99％，产品收率96-97％，对映体过量率98.5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘均洪，刘文，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37