本发明专利技术公开了一种类芽孢杆菌CGMCC No.8333的凝乳酶粗提物及其制备方法。所述的方法包括以下的步骤：(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的种子液以0.4～3.2％的接种量接种于麸皮培养基震荡发酵培养24～72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转速为160～180r/min，所述百分比为体积百分比；(2)将发酵液离心取上清液即可。所述的凝乳酶粗提物，总糖含量少，粘度较低，便于后续进一步的纯化，较好地满足了工业化生产凝乳酶的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种类芽孢杆菌CGMCC No. 8333凝乳酶粗提 物及制备方法。
技术介绍
与植物来源和动物来源的凝乳酶相比较，微生物来源的凝乳酶具有生产成本低、 生化多样性高、基因易改造的优势。目前，越来越多的报道说明微生物的胞外蛋白酶具有凝 乳功能，部分微生物的凝乳酶已实现大规模工业化生产，并广泛应用于干酪生产中。能够产 生具有一定凝乳作用的胞外蛋白酶的微生物主要属于放线菌、细菌和霉菌等的范畴，包括 放线菌中的链霉菌属、小单孢菌属、马杜拉放线菌属，霉菌中根霉、总状毛霉、微小毛霉、米 黑毛霉、易脆毛霉，细菌中粟疫菌、寄生内座壳菌以及其他通过基因工程或辐照获得的高产 凝乳酶的菌株。 将凝乳酶从发酵上清中分离出来并实现凝乳酶的高效回收是分离纯化、酶学性质 研究以及工业化生产凝乳酶的前提和基础。常用的分离方法有盐析法、有机溶剂沉淀法 (乙醇、丙酮）以及等电点法。然而这些方法适用于发酵上清黏度很低或不含有微生物胞外 多糖的情况。因此，探索开发一种能够有效降低发酵液中糖类含量的发酵方式，对于分离纯 化微生物源凝乳酶有着重要的意义。 中国专利申请（CN103740618A)公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种类芽孢杆菌 BD3526, Paenibacillusdamxungensissp. nov.,并且芽抱杆菌 BD3526 于 2013 年 10 月 14 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，该菌株的保藏编号为： CGMCC No. 8333。该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。但是 目前没有从该菌株中获得多糖含量较少的凝乳酶的记载。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对目前利用类芽孢杆菌麸皮发酵物制备凝乳酶 时，所得的发酵物粘稠难以将凝乳酶纯化分离，所得的凝乳酶回收率低，难以满足大规模工 业化生产的要求的不足，提供一种类芽孢杆菌CGMCC No. 8333的凝乳酶粗提物及其制备方 法。该方法在保证凝乳酶凝乳活力的前提下，有效降低了因多糖导致的发酵物黏度增加对 凝乳酶提取分离的影响。利用本专利技术所述的方法获得的凝乳酶多糖等杂质含量较少，便于 大规模工业化生产。 本专利技术的专利技术人发现，由于类芽孢杆菌CGMCC No. 8333的发酵液中胞外多糖含量 较高造成所得类芽孢杆菌发酵液较为粘稠，采用乙醇沉淀类芽孢杆菌CGMCC No. 8333的发 酵液时，多糖类代谢产物易伴随蛋白质沉淀析出。使离心后的上清液存在大量的糖类，粘度 过大，为后续凝乳酶的分离纯化带来一定的困难。然而通过适当延长类芽孢杆菌的发酵培 养时间、改变接种量以及降低摇床转速等培养方式，能使发酵液中的胞外多糖物质被类芽 孢杆菌代谢，降低培养物中胞外多糖类物质含量，同时结合后续发酵液的提纯工艺，能够进 一步降低所得凝乳酶中的杂质，以提高类芽孢杆菌凝乳酶的回收率。 本专利技术提供一种制备类芽孢杆菌CGMCC No. 8333的凝乳酶粗提物的方法，其包括 以下的步骤： (1)将保藏编号为CGMCC No. 8333的类芽孢杆菌的种子液以0· 4~3. 2%的接种 量接种于麸皮培养基震荡发酵培养24~72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转速为 160~180r/min，所述百分比为体积百分比； (2)将步骤（1)所得的发酵液离心取上清液即得凝乳酶粗提物。 步骤（1)为：将保藏编号为CGMCC No. 8333的类芽孢杆菌的种子液以0. 4~3. 2% 的接种量接种于麸皮培养基震荡发酵培养24~72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转 速为160~180r/min，所述百分比为体积百分比。其中，所述种子液的获得方式为本领域 常规的获得方式。较佳地，将保藏编号为CGMCC No. 8333的类芽孢杆菌在种子培养基上进 行种子培养获得种子液。所述的种子培养的培养基为本领域常规的培养基，较佳地为TYC 培养基，更佳地由以下组分组成：酪蛋白胨或胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5. Og/L， L-胱氨酸 0· 2g/L，乙酸钠 20g/L，Na2SO4O. lg/L，NaCl lg/L，Na2HPO4 · 12H20 2g/L，NaHC032g/ L，琼脂15~20g/L，余量为水。所述种子培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为20小 时。所述种子培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为30°C。所述的麸皮培养基为本领 域常规的麸皮培养基，其包括麸皮和水。所述的麸皮为本领域常规的麸皮，较佳地为小麦麸 皮。所述麸皮的含量为本领域常规的含量，较佳地为1 %~5%，更佳地为2%，所述百分比 为质量百分比。较佳地，所述发酵培养在锥形瓶中进行，更佳地在250mL锥形瓶中进行。所 述锥形瓶中所述的麸皮培养基的装液量为本领域常规装液量，较佳地为50mL。所述发酵培 养的时间为24~72h，较佳地为48~72h，更佳地为72h。所述种子液的接种量为0. 4~ 3. 2%，较佳地为0. 8~3. 2%，更佳地为0. 8%，所述百分比为体积百分比。所述震荡发酵 培养的转速为160~180r/min，较佳地为160~170r/min，更佳地为160r/min。所述发酵 培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为28~30°C，更佳地为30°C。 步骤⑵为：将步骤⑴所得的发酵液离心取上清液即得凝乳酶粗提物。其中，所 述离心完成后，初步获得了凝乳酶含量较高的粗提物。所述离心的时间为本领域常规的时 间，较佳地为10~15分钟。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为4°C。所述离 心的速度为本领域常规的速度，较佳地为15000g。 本专利技术提供一种由所述方法制得的凝乳酶粗提物。 所述的凝乳酶粗提物为浅棕色粉末状固体，且所述的凝乳酶粗提物中凝乳酶活 力达到2285. 71SU/mL，相对高转速（300r/min)摇床培养，总糖含量由3. 71mg/mL降低至 I. 33mg/mL，总糖含量降低了 64. 2% ;相对于短时发酵（12h)，糖含量降低72. 68% ;相对于 高菌体接种浓度（4. 0% )，糖含量降低80. 41%。因此，利用本专利技术所述的方法制得的凝乳 酶粗提物，总糖含量少，粘度较低，便于后续进一步的纯化，较好地满足了工业化生产凝乳 酶的要求。 较佳地，所述的方法还包括以下的步骤： (3)将步骤（2)所得上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的饱和 度为50~75 %，静置混合液，离心收集沉淀物； (4)将步骤⑶所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。 步骤（3)为：将步骤（2)所得上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵 的饱和度为50~75%，静置混合液，离心收集沉淀物。其中，较佳地，所述混合液中硫酸铵 的饱和度为60%。所述静置的温度为本领域常规的温度，较佳地为2~6°C。所述静置的 时间为本领域常规的时间，较佳地为0~5小时，更佳地为2小时。所述离心的时间为本领 域常规的时间，较佳地为15分钟。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为4°C。 步骤⑷为：将步骤⑶所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。其中，所 述溶解的溶剂为本领域常规的溶剂，较佳地为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备类芽孢杆菌CGMCC No.8333的凝乳酶粗提物的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的种子液以0.4～3.2％的接种量接种于麸皮培养基震荡发酵培养24～72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转速为160～180r/min，所述百分比为体积百分比；(2)将步骤(1)所得的发酵液离心取上清液即得凝乳酶粗提物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杭锋，王钦博，刘振民，陈卫，穆海波，王国骄，刘沛毅，洪青，雍靖怡，齐晓彦，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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