调控4对棉花DELLA蛋白基因GhGAIs表达的植物表达载体及其用途制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控4对棉花DELLA基因GhGAIs表达的植物表达载体及其用途。本发明专利技术要解决的技术问题是为提高棉花产量提供一种新选择。本发明专利技术的技术方案是利用RNAi技术同时调控4对棉花DELLA基因GhGAIs在棉花纤维中的表达。本发明专利技术还提供了含有所述载体的宿主细胞。经本发明专利技术载体对目标基因进行调控后，改良的棉花衣分和衣指明显提高，棉花产量潜力明显增加。本发明专利技术方法简便易行，效果显著，有产生巨大经济效益的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及调控4对棉花DELLA蛋白基因 GhGAIs表达的植物表达载体及其用途。
技术介绍
棉花是最重要的天然纤维作物，我国是世界上最大的产棉国和纺织品出口国，棉 花在我国国民经济中占有举足轻重的地位。 棉花纤维是由棉花外珠被表皮细胞经起始、伸长、次生壁合成和成熟四个时期发 育而成的单细胞纤维。植物激素对棉花纤维的发育起着非常重要的调控作用。在棉花纤维 和胚珠中上调赤霉素（GA)、生长素（IAA)和油菜素内酯（BR)合成酶基因，提高胚珠和纤维 中相关激素的水平，可以促进棉花纤维的起始或生长、定向改良棉花纤维产量和品质性状， 表明植物激素对棉花纤维的发育起着非常重要的调控作用。关于靶标植物激素信号转导元 件从而调控植物激素在纤维发育中信号转导的研究目前还很少。 DELLA蛋白是GA信号传导途径中一个关键的负调控因子。GA通过诱导DELLA蛋 白的泛素化和降解，解除DELLA蛋白的抑制，促进GA反应基因的表达。此外，多种激素和 环境信号都能直接或间接调控DELLA蛋白的降解，进而影响植物的生长发育及对环境的反 应。迄今为止还未见通过调控棉花DELLA基因来改良棉花纤维的报道。根据棉花基因组 测序的结果，棉花中DELLA蛋白由1个基因家族编码，单个棉花基因组含有4个编码基因， 而异源四倍体的陆地棉中含有4对编码基因，分别命名为GhGAIlA和GhGAI ID、GhGAI2A和 GhGAI2D、GhGAI3A和GhGAI3D、GhGAI4A和GhGAMD (表1)。每对基因为不同亚基因组（A和 D亚基因组）上的直系同源基因，相同核苷酸序列>95%。前人通过克隆及异源表达等手段 分析了部分棉花DELLA蛋白基因的功能，但目前还没有棉花DELLA蛋白基因在棉花纤维发 育中功能的报道，也没有通过调控DELLA蛋白基因改良棉花纤维产量品质的报道。 表1棉花DELLA蛋白基因及其在已测序的基因组中的编码序列
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为提高棉花产量提供一种新选择。 本专利技术的技术方案是调控4对棉花DELLA基因 GhGAIs表达的植物表达载和 GhGAI3D、GhGAMA 和 GhGAI4D。 具体的，所述载体包含串联了革El向所述4对基因的RNAi元件，该RNAi元件具有如 SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列。 具体的，调控所述RNAi元件的启动子为纤维次生壁合成期特异性启动子。 优选的，所述的启动子为棉花FbLate-2基因启动子（pFbl2)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 6 所示。 具体的，所述的植物表达载体具有如SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列。 本专利技术还提供了含有所述载体的宿主细胞。 具体的，所述的宿主细胞为根癌农杆菌。 本专利技术还提高棉花纤维产量的物质，其主要活性成分为所述植物表达载体，或者 含有所述植物表达载体的宿主细胞。 本专利技术还提供了所述的载体在提高棉花纤维产量中的用途。 本专利技术还提供了所述的宿主细胞在提高棉花纤维产量中的用途。 本专利技术的有益效果：本专利技术通过研究和分析，证明DELLA蛋白在棉花纤维生长发 育中具有重要作用。并通过在棉花纤维次生壁合成时期全面下调8个DELLA基因 GhGAIs的 表达，获得了衣分（棉花纤维占种子重量的百分比）和衣指（百粒棉籽上纤维的重量）明 显提高的转基因棉花。试验结果证明，经本专利技术载体对目标基因进行调控后，改良的棉花衣 分和衣指明显提高，纤维产量明显增加。本专利技术方法简便易行，效果显著，有产生巨大经济 效益的潜力。【附图说明】 图I =GAIsRNAi的表达载体T-DNA区的基因结构图 CaMV35S-P，花椰菜花叶病毒35S启动子；CaMV35S-T，花椰菜花叶病毒35S终止子； D1-D4,棉花GAI1-4基因的DELLA和VHYNP结构域的编码序列，两个反向重复的D1-D4串联 序列及间隔序列构成GAIsRNAi元件；GUS:NPTII，β -葡萄糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶融 合基因；LB，T-DNA左边界；Nos-T，农杆菌冠癭碱合成酶基因终止子；pFbl2,棉花FbLate-2 基因启动子；RB, T-DNA右边界。 图2 :P5-pFbl2-GAIRNAi表达载体构建流程 具体实验方法见实施例2。CaMV35S_P，花椰菜花叶病毒35S启动子；CaMV35S_T， 花椰菜花叶病毒355终止子；64^^〇^，4个棉花641片段的串联序列；《^ :即111，0-葡 萄糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶融合基因；LB，T-DNA左边界；Nos-T，农杆菌冠癭碱合成酶 基因终止子；pFbl2,棉花FbLate-2基因启动子；RB, T-DNA右边界；REP origin，质粒复制原 点。相关酶切位点及位置在各个载体上标出。 图3 :4对棉花DELLA蛋白基因 和GhGAI3D、GhGAMA和GhGAMD)在GAIsRNAi转基因棉花开花后18天纤维中的表达水平 WT代表非转基因棉花。FGi为GAIsRNAi转基因棉花，其后的数字显示不同的转化 子和纯合株系。【具体实施方式】 下述实施例中所用到的常规实验操作： I. DNA 的提取 基因组DNA采用植物基因组DNA快速提取试剂盒（Aidlab)提取，详细步骤见说明 书。 2. RNA 的提取 RNA采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab)提取，详细步骤见说明书。 3. DNA片段的PCR扩增 扩增体系如下：10XEx PCR buffer(Mg2+free)2. 5 yL，2. 5mmol/L dNTPs 2 yL， 25mmol/LMgCl22μL，引物l(5μmol/L)lμL，引物2(5μmol/L)lμL，ExTaqDNA聚合酶 1U，基因组DNA约60ng，加入ddH 20至25 μ L。 扩增程序为：94°C，5min ;94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，I. 5min，35 个循环；72°C 延伸lOmin。 4. DNA片段的回收、连接和克隆 使用BioFlux胶回收试剂盒回收DNA片段。使用T4 DNA Iigase进行DNA片段 连接。回收的片段与PUCm-T (上海生工）载体建立如下连接体系：IOX T4 DNA连接缓冲液 1 μ L，载体DNA片段1 μ L，外源连接产物DNA片段1 μ L，T4 DNA连接酶1 μ L，用双蒸水补足 体积至10 μ L。载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1 : 3,16°C连接12h。之 后将连接产物转化大肠杆菌DH5 α。获得的抗性克隆经液体培养过夜，用BioFlux质粒提取 试剂盒提取质粒，酶切验证后，在Invitrogen公司测序。 5.⑶S组织化学染色 由于实验室采用的表达载体具有⑶S报告基因，一般用⑶S组织化学染色检测 跟踪转基因。具体方法：取少量转基因棉花叶片（有伤口）置于96孔板中，加入GUS染 液，在37°C恒温条件下放置2h左右， 充分染液后再用75%乙醇脱色。植株叶片可被⑶S染液染成特异蓝色的植株为转基因阳 性。 实施例1调控棉花DELLA基因的RNAi元件GAIsRNAi的获得 DELLA蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
调控4对棉花DELLA蛋白基因GhGAIs表达的植物表达载体，所述的4对基因为GhGAI1A和GhGAI1D、GhGAI2A和GhGAI2D、GhGAI3A和GhGAI3D、GhGAI4A和GhGAI4D。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖月华，豆扬，王毅，覃元元，罗明，侯磊，李先碧，裴炎，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85