本文提供在细胞培养基中培养上皮干细胞和包含上皮干细胞的组织碎片的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请的交叉参考 本申请要求2013年2月25日提交的美国专利申请号61/769, 076的优先权，该美 国专利申请W其整体引入作为参考。
本文提供在细胞培养基中培养上皮干细胞和含有上皮干细胞的组织碎片（tissue fragment)的方法。
技术介绍
小肠上皮每2至5天更新，使它成为再生性最强的哺乳动物组织之一。已基于 定位和循环动态描述了小肠中的两类干细胞。参见例如Barker等，^^re449,1003 -1007 (2007) ;Sangiorgi,E.&Capecchi,M.R.化tureGenet.40,915 - 920 (2008); Li,L. &Clevers,H.Science327, 542 - 545 (2010)。快循环干细胞表达包括Lg巧、 Cdl33 (也称为Proml)和Sox9的标记，且存在于整个肠中。参见Zhu,L.等，化化re 457, 603 - 607 (2009) ;Rmiyama，K.等，化UireGenet. 43, ：34 - 41 (2011)。运些细长细 胞（也称为隐窝基底柱状细胞（CBC))3天内在隐窝和绒毛内繁殖，并散布在支持它们的 帕内特细胞间。参见Sato,T.等，化Uire469,415 - 418(2011) ;Cheng，H.化eblond，C. P.，Am.J.Anat. 141,537 - 561(1974)。WBmil或小鼠Ted(mTert)的富集表达为标记 的慢循环干细胞代表更稀少的细胞群体。参见Sangiorgi,E. &Capecchi,M.R.化化re Genet. 40, 915 - 920 (2008)。运些细胞从肠的近端区域至远端区域形成递减梯度，使得它们 在十二指肠中比在结肠中更普遍存在。尽管它们稀少，但表达Bmil的干细胞对隐窝维持至 关重要。 已描述了用于培养包括肠上皮干细胞的原代上皮干细胞的多种培养系 统（Bjerknes和化eng,MethodsEnz;ymol419, 337-83(2006);及Sato等，Nature 459, 262-265(2009))。迄今为止，培养系统倚赖于用固体胞外基质来培养原代上皮干细胞。 之前的研究已表明，固体胞外基质对维持上皮干细胞的多能性和保持已从结肠或肠分离的 隐窝的基本隐窝-绒毛生理学是必要的（参见例如W02010/090513)。已显示用ECM培养 干细胞增强了干细胞的长期存活和未分化干细胞的持续存在。之前，在缺乏ECM的情况下， 干细胞培养基不能较长时期培养，且未观察到未分化干细胞的持续存在。此外，ECM的存 在允许培养在缺乏ECM的情况下不能培养的S维组织类器官（organoid)。但是，由于该培 养系统的固体性质，对可用该培养系统研究的测试和诊断化合物的类型存在大小限制（例 如，大分子不能扩散入固体基质）。此外，由于细胞和高级结构包埋在固体基质中，分析细胞 和高级结构的容易程度降低（例如，必须从固体基质剖出高级结构（例如类器官）进行分 析）。需要更好的上皮干细胞（尤其是肠上皮干细胞）培养系统，该培养系统保持上皮干细 胞的生理学结构，维持上皮干细胞的多能性，并保持类器官的基本生理学，同时增加测试和 诊断化合物的类型及分析的容易程度。 专利技术概述 本文提供用于液体培养干细胞的方法。具体而言，本文提供用于液体培养（a)上 皮干细胞和/或化）分离的包含上皮干细胞的上皮组织碎片的方法，该方法包括在液体细 胞培养基（liquidcellculture)中解育上皮干细胞和/或分离的组织碎片，该液体细胞 培养基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向该基础培养基加入（i)骨形态发生蛋 白度MP)抑制剂、扣）促细胞分裂生长因子、（iii)Wnt激动剂和（iv)至少约4%w/v的胞 外基质巧CM)。此外，本文提供用于获得和/或培养隐窝的方法，该方法包括在液体细胞培 养基中解育上皮干细胞和/或分离的组织碎片，该液体细胞培养基包含用于动物细胞或人 细胞的基础培养基，向该基础培养基加入（i)骨形态发生蛋白度M巧抑制剂、（ii)促细胞 分裂生长因子、（iU)Wnt激动剂和（iv)至少约4%w/v的胞外基质巧CM)。 在任意方法的一些实施方案中，该BMP抑制剂是头蛋白、DAN和/或DAN样蛋白， 包括Cerberus和Gremlin。在一些实施方案中，该BMP抑制剂是头蛋白。在一些实施方案 中，该BMP抑制剂在该液体细胞培养基中的浓度在约5和约500ng/ml之间（例如约50至 约lOOng/mL)。 在任意方法的一些实施方案中，该Wnt激动剂是Wnt、R-spondin(RSPO)、Norrin 和/或GSK抑制剂。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSPO。在一些实施方案中，该Wnt 激动剂是RSP01。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSP02。在一些实施方案中，该Wnt 激动剂是RSP03。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSP04。在一些实施方案中，该Wnt 激动剂在该液体细胞培养基中的浓度在约50化g/mL和约5yg/ml之间（例如约500至约 1500ng/mL)〇 在任意方法的一些实施方案中，该促细胞分裂生长因子是上皮生长因子巧GF)、转 化生长因子-a(TGF-a)、碱性成纤维细胞生长因子化FGF)、脑衍生神经营养因子度DNF) 和角质形成细胞生长因子（KGF)。在一些实施方案中，该促细胞分裂生长因子是EGF。在一 些实施方案中，该促细胞分裂生长因子在该液体细胞培养基中的浓度在约5和约50化g/ml 之间（例如约5至约50ng/mL)。 在任意方法的一些实施方案中，该ECM是低生长因子ECM(g;rowthfactorrecced ECM)。在一些实施方案中，该ECM是基质胶。在一些实施方案中，该ECM在该液体细胞培养 基中的浓度在约4%至约10%w/v之间。在任意方法的一些实施方案中，该方法包括悬滴 培养。 在任意方法的一些实施方案中，该培养基进一步包含Rock巧ho激酶）抑制剂。 在任意方法的一些实施方案中，该培养基进一步包含Notch激动剂。 在任意方法的一些实施方案中，该上皮干细胞和/或上皮组织碎片是胃肠干细胞 和/或胃肠组织碎片。在一些实施方案中，该胃肠干细胞和/或胃肠组织碎片是小肠干细 胞和/或小肠组织碎片。 本文还提供可通过本文所述的方法获得的隐窝及该隐窝在药物发现筛选、毒性测 定中或在再生医学中的用途。 附图简述图1A-B. (A)源自小鼠的类器官在隐窝样结构中显示膜GFP化胖5阳性 干细胞）和溶菌酶染色（帕内特细胞，箭头）。度）光学横截面。 阳01引图2A-D.在存在度、B-1、D)或缺乏（A、A-1、C)白喉毒素值T)的情况下培养源自Lgr5°?wp小鼠的类器官10天。隐窝样结构和溶菌酶阳性细胞保持在DT处理的类器官中 度、B-1)。类器官在DT的存在下持续增殖值）。 图3A-D.在多种浓度的基质胶中培养源自Lgr5°?wp小鼠的类器官。 专利技术详述 阳〇2U I.定义 术语"多肤"在本文中指天然序列多肤、多肤变体及天然序列多肤和多肤变体（其 在本文中进一步定义）的片段。本文本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于液体培养(a)上皮干细胞和/或(b)分离的包含上皮干细胞的上皮组织碎片的方法，所述方法包括在液体细胞培养基中孵育所述上皮干细胞和/或所述分离的组织碎片，所述液体细胞培养基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向所述基础培养基加入(i)骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、(ii)促细胞分裂生长因子、(iii)Wnt激动剂和(iv)至少约4％w/v的胞外基质(ECM)。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·比艾斯，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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