本发明专利技术涉及一种抗菌素及其制备方法与应用，制备方法为：先将乳酸乳球菌ATCC 11454菌种活化后，挑取单菌落进行培养，离心去除菌种得到发酵液，将发酵液pH调至2后再利用旋转蒸发浓缩，再将pH调至初始值然后离心后取上清，过滤处理后得到发酵浓缩液；将发酵浓缩液与PBS缓冲液混合，再加入Triton X-114和MgSO4构成的双水相体系，离心使双水相达到相平衡后取上相，再用PBS缓冲液稀释后制得含乳酸链球菌素和Triton X-114的抗菌素。本发明专利技术的抗菌素对革兰氏阳性细菌有显著的抑菌效果。本发明专利技术的抗菌素包含Nisin和Triton X-114，两者的结合使得抗菌素具有较高的效价。本发明专利技术的提取工艺简单、成本低，适用于间歇性和规模化生产加工高效价、高收率的抗菌素。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及天然产物深加工
，具体涉及一种抗菌素及其制备方法与应 用。
技术介绍
Nisin亦称乳酸链球菌素，是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，是一种细菌抗菌 肽，仅有34个氨基酸组成，分子量为3510Da左右，其活性分子常以二聚体和四聚体的形式 存在。乳酸链球菌素由亲水端和疏水端构成，是典型的表面活性物质。Nisin对大多数革 兰氏阳性细菌均有抑制能力，产芽孢的革兰氏阳性菌种对Nisin尤其敏感。在一般情况下， Nisin对革兰氏阴性菌种、酵母和霉菌无抑制效果。因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品 行业。食用后在人体的生理pH条件和a-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改 变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其它抗菌素出 现交叉抗性，具有高效、无毒、无残留、无耐药性、耐酸、耐高温、安全、高效等优点，在生物饲 料添加、食品防腐保鲜以及药物治疗方面有着广阔的应用前景。 目前Nisin的生产主要以乳酸乳球菌为生产菌，采用经蛋白酶处理的巴氏灭菌奶 和酵母膏作为培养基，在一定条件下进行发酵、提取获得。工业上常用的提取方法有有机溶 剂法、吸附法、膜分离法和柱层析法。有机溶剂法是分离Nisin的经典方法，操作简便，但回 收率低，产物活性低；吸附法能使产物保持较高的活性，但当发酵液中的Nisin浓度超过细 胞吸附能力时，只能回收部分Nisin，损失率较高；用膜分离法得到的产物纯化效果不佳， 杂质较多；柱层析法能获得较高纯度的产物，但是处理量小，分离时间长。 这些分离纯化工艺的不足导致Sigma公司生产的Nisin价格昂贵，纯度只有 2. 5% ;而国产的Nisin价格虽然不高，其效价、纯度和稳定性都非常低。这使得高效价、高 纯度Nisin的获得及其广泛应用受到影响。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种抗菌素及其制备方法解决现有乳酸链球菌素生产时分 离纯化工艺的不足，价格昂贵，效价、纯度和稳定性都非常低等问题。 为了实现上述的目的，采用如下的技术方案： 本专利技术的抗菌素的制备方法包括如下步骤： 步骤一，将乳酸乳球菌ATCC11454菌种活化后，挑取单菌落进行培养，离心处理 后去除菌种，获得乳酸乳球菌发酵液； 步骤二，将步骤一所得发酵液pH调至2以下，再利用旋转蒸发浓缩，再将pH调至 初始值，然后离心处理后取上清，过滤处理后得到乳酸乳球菌发酵浓缩液； 步骤三，取步骤二所得发酵浓缩液与PBS缓冲液以重量比2:1混合，再加入Triton X-114和MgSO4M合液构成双水相体系，离心处理使双水相达到相平衡后取上相，再用PBS 缓冲液稀释后制得包含乳酸链球菌素和TritonX-114的抗菌素。 该方法通过乳酸乳球菌的培养、旋转蒸发浓缩和TritonX-IlVMgSO4双水相体系 萃取制得抗菌素，抗菌素中包含抗菌肽乳酸链球菌素和具有抑菌效果的表面活性剂Triton X-114,两者的结合起协同作用使得抗菌素具有较高的效价。 抗菌肽乳酸链球菌素在酸性条件下耐高温，旋转蒸发前先将发酵液pH调至2以下 有利于避免活性损失。 进一步的，步骤一所述培养包括活化培养24-26h，平板划线培养18-20h，种子液 培养20-22h和扩大培养16-18h;所述培养均在29-31°C恒温培养箱中。 进一步的，步骤二所述过滤处理为用0. 2-0. 25ixm的滤膜过滤至少一次除菌。 进一步的，步骤三所述发酵浓缩液、所述TritonX-114和所述1%304重量比为 (15. 5-15. 7) : (0? 95-1. 05) : (0? 144-0. 156);所述PBS缓冲液浓度为 0? 018-0. 022M。 进一步的，所述双水相体系的相比为0. 21-0. 23。 进一步的，所述离心处理为在24_26°C，11000-13000rpm的条件下离心28_32min。 -种上述制备方法制备的抗菌素。 上述抗菌素的应用，主要是对革兰氏阳性细菌有显著的抑菌效果。 进一步的，所述革兰氏阳性细菌包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和酿脓链球 菌。其抑菌效果顺序为：枯草芽孢杆菌〉金黄色葡萄球菌〉酿脓链球菌，而对三种革兰氏阴 性菌种（大肠杆菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌）均无明显抑制作用。抗菌素抑菌活性用其 抑菌效价衡量，所用方法为琼脂扩散法，选用金黄色葡萄球菌为敏感菌。 进一步的，所述抗菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌效价为9143IU/mL，抗菌素中富集 分离得到的乳酸链球菌素效价为3210IU/mL。本专利技术所得抗菌素抑菌活性用其抑菌效价衡 量，所用方法为琼脂扩散法，选用金黄色葡萄球菌为敏感菌。对金黄色葡萄球菌的抑菌效价 可达到Sigma公司乳酸链球菌素标准品（0.01g/mL)效价的91. 43%。抗菌素中富集分离得 到的乳酸链球菌素效价占抗菌素总效价的35. 11%。 与现有技术相比，本专利技术采用旋转蒸发浓缩和TritonX-IlVMgSO4双水相萃取， 避免了传统提取技术活性低、收率低等弊端，提取工艺简单、成本低，适用于间歇性和规模 化生产加工高效价、高收率的抗菌素成品。本专利技术制得的抗菌素同时包含抗菌肽乳酸链球 菌素和表面活性剂TritonX-114,两者的结合起协同作用使得抗菌素具有较高的效价，对 革兰氏阳性菌种有良好的抑菌效果。【附图说明】 图1是本专利技术的抗菌素制备工艺流程图； 图2是本专利技术实施例中发酵浓缩液的Tricine-SDS-PAGE图，M表示Marker，F表 示发酵浓缩液，S表示Sigma公司生产的乳酸链球菌素标准品； 图3是进行抑菌实验时标准品与样品的加样方式，Si表示乳酸链球菌素标准品， Ul表示未知效价样品； 图4是本专利技术制得的抗菌素与双水相分配乳酸乳球菌培养基对金黄色葡萄球菌 的抑菌效价，实验组是抗菌素，对照组双水相分配乳酸乳球菌培养基；上相是乳酸链球菌 素和TritonX-114的抗菌素，下相是MgSO4和相对少量损失的乳酸链球菌素和Triton X-114 ；图5是本专利技术制得的抗菌素与发酵浓缩液的抑菌效价对比图；上相即是含乳酸链 球菌素和TritonX-114的抗菌素；图6是本专利技术制得的抗菌素对枯草芽孢杆菌的抑制效果； 图7是本专利技术制得的抗菌素对酿脓链球菌的抑制效果。【具体实施方式】 为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一 步地详细描述。 实施例1 抗菌素的制备 (1)制备乳酸乳球菌发酵液：根据表1的配方配制培养基，在115°C灭菌30min后， 将购买的菌种乳酸乳球菌ATCC11454干粉用0.5mL液体培养基溶解，再以5% (v/v)的比 例接入5mL液体培养基中，在30°C恒温培养箱中活化培养24h。待菌种活化后，将25mL固 体培养基倒入平板中，用接种针取少许活化好的菌液划线接种于平板上，在30°C条件下培 养18h。长出菌种后，挑取单菌落接种于30mL种子液培养基中，在30°〇〖旦温培养箱中培养 20h。然后将培养好的种子液以3% (v/v)的比例接种于新鲜的200mL液体培养基中进行发 酵培养，培养条件为30°C培养16h。培养完毕后，将发酵液在25°C，12000rpm的条件下离心 30min，取上清液，制得乳酸乳球菌发酵本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗菌素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，将乳酸乳球菌ATCC 11454菌种活化后，挑取单菌落进行培养，离心处理后去除菌种，获得乳酸乳球菌发酵液；步骤二，将步骤一所得发酵液pH调至2以下，再利用旋转蒸发浓缩，再将pH调至初始值，然后离心处理后取上清，过滤处理后得到乳酸乳球菌发酵浓缩液；步骤三，取步骤二所得发酵浓缩液与PBS缓冲液以重量比2:1混合，再加入Triton X‑114和MgSO4混合液构成双水相体系，离心处理使双水相达到相平衡后取上相，再用PBS缓冲液稀释后制得包含乳酸链球菌素和Triton X‑114的抗菌素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘杨，刘黎玲，李夏云，肖湘，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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