具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗光漂白、具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法，本发明专利技术首先在稍高的温度下将柠檬酸热解缩合成较小的碳点骨架，然后再在稍低温度下与L-半胱氨酸缩合形成碳点。该碳点表面有大量的半胱氨酸残基，呈现蓝色荧光强度较高且具有持续高尔基体靶向能力的碳点，避免了常规方法繁冗的后续修饰步骤。通过本发明专利技术所述方法获得的蓝色碳点的绝对量子产率高达68％，并且该碳点具有良好的抗光漂白性和生物相容性，为检测细胞生理过程与疾病诊断等提供了更精确的帮助。

【技术实现步骤摘要】
具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法
本专利技术属于生物成像
，具体涉及一种抗光漂白、具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法。
技术介绍
高尔基体(Golgiapparatus,Golgicomplex)是真核细胞的细胞器之一，既是蛋白质修饰、分选、水解加工的场所，又是分泌物质的转运站。高尔基体的荧光成像对研究细胞内生理活动及与高尔基体相关疾病的生理过程都有重要作用。自1985年Lipsky等将NBDC6-ceramide用于高尔基体荧光成像后，神经酰胺类似物便成为高尔基体荧光靶向定位的常用染料。但是这种神经酰胺类似物随着细胞的代谢也会出现在线粒体与细胞质膜上，且实际应用表明该类物质具有细胞毒性。因此，非常有必要发展一种生物相容性好，具有长时间高尔基体靶向性能的荧光探针。碳量子点(carbonquantumdots，简称碳点)，是继富勒烯、碳纳米管及石墨烯之后最热门的碳纳米材料之一。碳点不仅呈现出优良的光学活性与较小尺寸的特性，且生物相容性良好。从2004年碳点首次报道以来，许多研究者通过改变碳源及合成方法制备出了一系列不同荧光颜色与量子产率的碳点。目前，碳点已广泛应用于生物成像，但是其在单个细胞中的分布较为分散，并不能对细胞中的某个细胞器进行精确定位。因此制备一种具有良好生物相容性，且同时具有良好高尔基体靶向与成像能力的碳点是一项非常有挑战性且应用前景极好的工作。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法，所述碳点能够精确对细胞中高尔基体进行定位，且具有良好的抗光漂白性和生物相容性。本专利技术通过下述技术方案达到所述目的:1、具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，制备方法包括如下步骤:1)、按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25～1:1的比例，取柠檬酸并在150～250℃条件下加热0～20min，获得产物A；2)、取一定配比量的L-半胱氨酸和产物A混合，140～250℃加热3～60min，获得固体产物B；3)、先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至6～8，然后用0.22μm的滤膜进行过滤，再用截留分子量500～1000Da的透析袋透析12～48h，冷冻干燥即得碳点。优选的，所述步骤1)中所述柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:1。优选的，所述步骤1)中所述加热温度为200℃，加热时间为20min。优选的，所述步骤2)中所述加热温度为150℃，加热时间为50min。优选的，所述步骤3)中先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至7。2、制备具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点的方法，包括如下步骤:1)、按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25～1:1的比例，取柠檬酸并在150～250℃条件下加热0～20min，获得产物A；2)、取一定配比量的L-半胱氨酸和产物A混合，140～250℃加热3～60min，获得固体产物B；3)、先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至6～8，然后用0.22μm的滤膜进行过滤，再用截留分子量500～1000Da的透析袋透析12～48h，冷冻干燥即得碳点。本专利技术研究发现，L-半胱氨酸的量相对太少或者加入半胱氨酸后的温度太高都会使碳点的靶向成像能力减弱，因此，本专利技术通过实验研究最终获得柠檬酸与L-半胱氨酸的最佳质量比范围，以及加热的温度范围。另外，在本专利技术中，步骤2)中会产生硫化氢气体，所以需要注意废气的处理以免对人体造成伤害，在加热的过程中需要用玻璃棒将两种物质搅拌均匀。本专利技术的有益效果在于:本专利技术首先在稍高的温度下将柠檬酸热解缩合成较小的碳点骨架，然后再在稍低温度下与L-半胱氨酸缩合，在最终形成碳点的同时也使碳点表面带上大量半胱氨酸残基，最终获得蓝色荧光强度高且具有持续高尔基体靶向能力的碳点，避免了常规方法繁冗的后续修饰步骤。通过本专利技术所述方法获得的蓝色碳点的绝对量子产率高达68％，且该碳点具有良好的抗光漂白性和生物相容性，为检测细胞生理过程与疾病诊断等提供了更精确的帮助。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图:图1碳点的高分辨透射电镜图片，其中a图为在较低放大倍数下大量碳点的宏观图片，b图为较高放大倍数下碳点面内晶格图，c图为较高放大倍数下碳点面间晶格图。图2碳点的X射线光电子能谱图，其中a图为碳点总体的X射线光电子能谱，b图为C1s的X射线光电子能谱，c图为N1s的X射线光电子能谱，d图为S2p的X射线光电子能谱；a图中位于285eV左右的峰归属于碳元素，399eV左右的峰归属于氮元素，531eV左右的峰归属于氧元素，163eV左右的峰归属于硫元素；b图中键能为288.0eV的峰归属于羰基碳，键能为285.2eV的峰归属于与氮氧硫等以单键相连的碳，键能为284.6eV的峰归属于与其他碳原子单键相连的碳；c图中键能为399.3eV的峰为吡啶型N的峰，400.1eV的峰为吡咯型N的峰；d图中可分别得到S2p1/2与S2p3/2的电子结合能，它们分别位于164.5eV与162.8eV；另图中符号代表如下：C：碳元素；N：氮元素；O：氧元素；S：硫元素；1,2：主量子数；s,p：原子轨道；1/2,3/2：磁量子数和自旋量子数的和，其中自旋量子数取得是1/2和-1/2。图3碳点的傅立叶转换红外吸收光谱，图中符号代表如下:-OH：羟基；-NH：氨基；-SH：巯基；C＝O：羰基；COO-：酯；-CH(1)：烷基；-CH(2):烷基；3430cm-1、3240cm-1、2978cm-1、2526cm-1、1708cm-1、1581cm-1、1388cm-1分别表示碳点中羟基、氨基、烷基(1)、巯基、羰基、酯、烷基(2)的红外特征吸收峰。图4碳点的荧光光谱与紫外可见吸收光谱及其在自然光和紫外光下的图片；碳点的荧光最大发射位于420nm处，最大激发位于350nm处；碳点在350nm处有良好的紫外吸收，在245nm左右有良好的紫外吸收肩峰；a图为自然光下图片，b图为紫外光下图片。图5碳点的细胞毒性实验结果。图6碳点靶向高尔基体在转盘共聚焦显微成像系统下的照片；其中，a图为共聚焦显微镜下与碳点共同孵育的喉癌细胞(HEp2)明场图，b图为共聚焦荧光显微镜下碳点的荧光图片(蓝色)，c图为共聚焦荧光显微镜下高尔基体特异性荧光染料NBDC6-ceramide的荧光图，d图为明场与荧光通道下图片的重合图。图7以D-半胱氨酸、硫代乙酰胺、L-丙氨酸、s-甲基-L-半胱氨酸为碳源获得的碳点的细胞成像图；其中，图a1-a3依次为D-半胱氨酸碳点的细胞成像图，图b1-b3依次为硫代乙酰胺碳点的细胞成像图，图c1-c3依次为L-丙氨酸碳点的细胞成像图，图d1-d3依次为s-甲基-L-半胱氨酸碳点的细胞成像图，其中，1为细胞的明场图，2为荧光成像图，3为明场图和荧光图的叠加图，标尺为20μm。图8碳点长时间靶向高尔基体的转盘共聚焦显微成像系统拍摄图片；图a1-d1为不同时间下碳点在荧光通道下的图片，a2-d2为细胞在明场通道与荧光通道下的叠加图。图9碳点抗光漂白性能研究结果；a1-d1为碳点在荧光显微镜激光下连续激发60min的图片，a2-本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，其特征在于，制备方法包括如下步骤:1)、按柠檬酸与L‑半胱氨酸的质量比为1:0.25～1：1的比例，取柠檬酸并在150～250℃条件下加热0～20min，获得产物A；2)、取一定配比量的L‑半胱氨酸和产物A混合，140～250℃加热3～60min，获得固体产物B；3)、先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至6～8，然后用0.22μm的滤膜进行过滤，再用截留分子量500～1000Da的透析袋透析12～48h，冷冻干燥即得碳点。

【技术特征摘要】
1.具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，其特征在于，制备方法包括如下步骤:1)、按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25~1：1的比例，取柠檬酸并在150~250oC条件下加热0~20min，获得产物A；2)、取L-半胱氨酸和产物A混合，140~250oC加热3~60min，获得固体产物B；3)、先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至6~8，然后用0.22μm的滤膜进行过滤，再用截留分子量500~1000Da的透析袋透析12~48h，冷冻干燥即得碳点。2.根据权利要求1所述具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，其特征在于，所述步骤1)中所述柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:1。3.根据权利要求1所述具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，其特征在于，所述步骤1)中所述加热温度为200oC，加热时间为20min。4.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王健，李荣生，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85