本发明专利技术涉及一种利用响应曲面法优化白刺多糖的复合酶微波提取方法，该方法包括以下步骤：⑴样品制备：将新鲜白刺果实制成白刺果粉；然后按不同的料液比、不同浸泡时间、不同微波功率、不同提取时间进行反应提取，得到对应于不同微波功率的白刺多糖提取物干燥粉末；⑵用苯酚-硫酸法测定每个提取液中多糖含量；⑶实验设计与统计分析：①单因素试验；②响应面法优化设计：根据单因素试验结果，选取多糖提取效果影响较显著的微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比这4个因素建立多元二次回归方程；⑷实验结果分析与优化：利用Design Expert 8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。本发明专利技术操作简单、提取率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及生物
，尤其设及一种利用响应曲面法优化白刺多糖的复合酶 微波提取方法。
技术介绍
裝襲科白刺属（化'fraria)植物是一个古老的小属，旱生或超旱生灌木、小灌木，全 世界已发现12种，我国有8种，主要分布在青海、新疆、甘肃、宁夏、内蒙古等地，资源十分丰 富。其中唐古拉特白刺（化卵toruffl)和西伯利亚白刺（化是西部蒙、藏、维 等少数民族的传统药材，用于多种疾病的治疗，经常在中、藏药复方中出现。现代药理学研 究表明，白刺果实提取物具有降血脂、抗氧化、降血糖的作用，其所含黄酬类、生物碱类、月旨 肪酸类化合物是其重要活性成分。近年来，研究人员发现白刺果实中所含的维生素及矿质 元素对人体也具有明显的保健作用。 目前白刺果实化学成分和药理作用的研究绝大多数集中在黄酬等小分子化合物， 对于多糖等活性生物大分子的研究较少。王凌云等（2006)对唐古特白刺果实多糖的提取 工艺进行了研究，通过正交实验对传统热水回流提取法的参数进行了优化。结果表明，在料 液比为1:5,94°C下回流提取3次，每次化的条件下得到的白刺多糖含量为34. 562mg/g。 张玲等（2013)对白刺果实水溶性多糖的单糖组成进行了研究。白刺果实经石油離脱脂后， 采用80 °C热水浸提法提取果粉中的水溶性糖，料液比1 ; 10 (g/mL)，提取2h，重复 提取3次，己醇沉淀，Sevage法除蛋白，反复醇洗脱色，经低温干燥得到水溶性多糖(得 率约为1%)。单糖组成经测定，包括甘露糖、鼠李糖、半乳糖醒酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯 糖，其质量比约为 9.2 ; 3.3 ; 1.1 ; 1 ; 1.9 ; 2. 3。 传统提取方法效率低、操作复杂、周期长，且其中Sevag法脱蛋白处理所设及的氯 仿和正了醇，处理不当很容易造成有害溶剂残留，产生健康安全隐患。此外，白刺多糖的生 物学活性不明确，导致其产品开发没有方向，严重制约了白刺多糖的高值利用。因此，为了 合理和高效利用白刺资源，亟需提供一种操作简单、提取率高、安全的从白刺果实中制备活 性多糖的方法。有关复合酶-微波辅助提取白刺抗衰老活性多糖的专利未见申请。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单、提取率高的利用响应曲面法优 化白刺多糖的复合酶微波提取方法。 为解决上述问题，本专利技术所述的一种利用响应曲面法优化白刺多糖的复合酶微波 提取方法，包括W下步骤： 山样品制备： 将新鲜白刺果实洗净，在30~35°C温度下烘干48~7化后粉碎至40~80目，按10~30血/g料液比加入体积浓度为80%的己醇溶液，在18°C~25°C浸泡2~化后过滤，得到滤渣，该滤 渣于40~60°C下干燥12~2化，即得脱除脂类、色素和小分子糖的白刺果粉；然后在微波反应 器中，按10~18血/g不同的料液比加入复合酶溶液，40~50°C静置浸泡1. 5~2.化的不同时 间，在330~370W的不同微波功率下按25~35min的不同时间进行反应提取，提取后的溶液 分别W4000~5000转/min进行离心15~20min后收集上清液A，该上清液A经50~60°C真 空旋转蒸发浓缩至原体积的1/6~1/8后，得到浓缩产物；所述浓缩产物中加入其体积3~4 倍的无水己醇溶液混匀，当其溶液中己醇浓度为80%时，于2~6°C下静置12~2化，再分别W 4000~5000转/min进行离屯、，15~20min后收集沉淀；沉淀加水复溶后，W4000~5000转/min 进行离屯、，15~20min后收集上清液B，该上清液B于-70°C~ -85°C预冻4~6h，最后在大气 压力为10~100化、温度为-55°C~ -70°C的条件下冷冻干燥24~72h，得到对应于不同微波功 率的白刺多糖提取物干燥粉末； 所述复合酶溶液是指蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等质量混合后加去离子水配制而成的 抑为4~5的溶液； 口)用苯酪-硫酸法测定每个提取液中多糖含量： ① 标准曲线制作： 准确称取10mg葡萄糖，配制成浓度为0. 1mg/mL的溶液，分别取0血、0. 1mL、0.2血、 0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0.6mL，依次补加蒸馈水至1mL;W蒸馈水作对照，分别向其中加 入0.5血6%的苯酪，振荡摇匀，垂直快速加入2.5血浓H2SO4,振荡摇匀后，静止约30min, 冷却至室温，然后在490nm波长下测吸光值，W糖溶液浓度yg/mL为横坐标，吸光值为纵 坐标，绘制标准曲线； ② 样品中多糖含量的测定： 将样品配置成60yg/mL的溶液，取样品1mU不加蒸馈水，其余操作均与所述步骤① 制作标准曲线相同；在490nm波长下比色，所得数值在标准曲线上查出相应的总糖含量； 樹实验设计与统计分析： ① 单因素试验： 依次改变微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比进行单因素试验，用苯酪-硫酸法测 定所得的白刺多糖提取物中多糖的含量，并按下式计算多糖产率，每次处理重复=次： 多糖产率（％)=X100%; ② 响应面法优化设计： 根据单因素试验结果，选取多糖提取效果影响较显著的微波功率、提取时间、浸泡时 间、料液比该4个因素，利用Desi即Expert8. 0软件根据Box-Behnken设计原则进行实验 设计，W微波功率Xi、提取时间X2、浸泡时间X3和料液比X4为自变量，W多糖的产率为响应 值y，建立多元二次回归方程： y= -23. 15167 + 0. 12368Xi+ 0. 37283X2-0. 84933X3+0. 096067X4-6. 4X10-4x1X2+5.0X10-4X1X3+ 3.1X10-4X1X4-3.0X10-3X2X3+7.0X10-4X2X4-0.031X3X4- 1. 563Xl〇-4Xi2- 2. 42XlO^a'+O. 462X10-3X32- 5. 89X10-3X42; (4)实验结果分析与优化： 利用DesignExpert8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的 响应面及其等高线图。所述白刺为唐古特白刺（Nitrariataugutorum)或西伯利亚白刺（Nitraria sibirica)的成熟果实。[000引本专利技术与现有技术相比具有w下优点： 1、本专利技术不仅利用复合酶酶解技术破坏植物细胞壁促进细胞内活性多糖成分的充分 溶出、水解果实中蛋白质成分提高多糖含量、避免氯仿等有害溶剂造成的安全隐患，而且利 用低功率微波穿透式内外加热，在降低活性多糖结构破坏风险的同时促进多糖溶出、节省 提取时间。 2、与正交法相比，本专利技术采用Box-Behnken Desi即S炬抓）中屯、组合设计模型的 响应面分析法，用4个变化因子、3个水平及少量的实验组(仅29组实验）就可W得出优化 结果，获得最佳产率，在提高了提取效率的同时降低了能耗和污染物排放，具有工业化生产 的实际意义；并且所得的最佳提取条件不是设定的值，而是在设定条件的范围之内。 3、本专利技术获得的白刺多糖最终产品为褐色粉末，易溶于水，经测试其糖含量为 58. 33%，糖醒酸含量为2. 62%，不含蛋白质，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醒酸、甘露糖和 半乳糖组成，不仅能够有效阻止自由基的产生，而且能够本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用响应曲面法优化白刺多糖的复合酶微波提取方法，包括以下步骤：⑴样品制备：将新鲜白刺果实洗净，在30~35℃温度下烘干48~72h后粉碎至40~80目，按10~30 mL/g料液比加入体积浓度为80%的乙醇溶液，在18℃~25℃浸泡2~4h后过滤，得到滤渣，该滤渣于40~60℃下干燥12~24h，即得脱除脂类、色素和小分子糖的白刺果粉；然后在微波反应器中，按10~18 mL/g不同的料液比加入复合酶溶液，40~50℃静置浸泡1.5~2.5h的不同时间，在330~370W的不同微波功率下按25~35 min的不同时间进行反应提取，提取后的溶液分别以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集上清液A，该上清液A经50~60℃真空旋转蒸发浓缩至原体积的1/6~1/8后，得到浓缩产物；所述浓缩产物中加入其体积3~4倍的无水乙醇溶液混匀，当其溶液中乙醇浓度为80%时，于2~6℃下静置12~24h，再分别以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集沉淀；沉淀加水复溶后，以4000~5000转/min进行离心，15~20min后收集上清液B，该上清液B于‑70℃~ ‑85℃预冻4~6 h，最后在大气压力为10~100Pa、温度为‑55℃~ ‑70℃的条件下冷冻干燥24~72h，得到对应于不同微波功率的白刺多糖提取物干燥粉末；所述复合酶溶液是指蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等质量混合后加去离子水配制而成的pH为4~5的溶液；⑵用苯酚‑硫酸法测定每个提取液中多糖含量：①标准曲线制作：准确称取10 mg葡萄糖，配制成浓度为0.1 mg/mL的溶液，分别取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，依次补加蒸馏水至1 mL；以蒸馏水作对照，分别向其中加入0.5 mL 6%的苯酚，振荡摇匀，垂直快速加入2.5 mL浓H2SO4，振荡摇匀后，静止约30 min，冷却至室温，然后在490 nm波长下测吸光值，以糖溶液浓度μg/mL为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线；②样品中多糖含量的测定：将样品配置成60 μg/mL的溶液，取样品1 mL，不加蒸馏水，其余操作均与所述步骤①制作标准曲线相同；在490 nm波长下比色，所得数值在标准曲线上查出相应的总糖含量；⑶实验设计与统计分析：①单因素试验：依次改变微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比进行单因素试验，用苯酚‑硫酸法测定所得的白刺多糖提取物中多糖的含量，并按下式计算多糖产率，每次处理重复三次：多糖产率（%）=[(多糖含量×提取物重量)/ 果粉重量]×100%；②响应面法优化设计：根据单因素试验结果，选取多糖提取效果影响较显著的微波功率、提取时间、浸泡时间、料液比这4个因素，利用Design Expert 8.0软件根据Box‑Behnken设计原则进行实验设计，以微波功率X1、提取时间X2、浸泡时间X3和料液比X4为自变量，以多糖的产率为响应值y，建立多元二次回归方程：y=‑23.15167+0.12368X1+0.37283X2‑0.84933X3+0.096067X4‑6.4×10‑4X1X2 +5.0×10‑4X1X3+ 3.1×10‑4X1X4‑ 3.0×10‑3X2X3+ 7.0×10‑4X2X4‑ 0.031X3X4‑ 1.563×10‑4X12‑ 2.42×10‑3X22+0.462×10‑3X32‑ 5.89×10‑3X42；⑷实验结果分析与优化：利用Design Expert 8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毕宏涛，魏立新，高婷婷，杜玉枝，杨红霞，李岑，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：青海;63
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