本发明专利技术公开了一种催化合成阿扎那韦中间体的方法，包括制备磁性修饰的介孔材料，将羰基还原酶与辅酶共固定化于磁性介孔材料，并用该固定化酶催化 (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁酮生成 (3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇中间体。本发明专利技术具有羰基还原酶与辅酶的回收利用率高、辅酶再生效率高、成本低、市场前景广阔等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种羰基还原酶与辅酶共固定化体系催化合成阿扎那韦中间体 (3S) -3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇的方法，属于生物技术和生物制药 领域。
技术介绍
目前，艾滋病治疗药物主要有三大种类，其中蛋白酶抑制剂（Pls)具有相当强的 抗HIV作用，是目前经常使用的药物(约占26%)。抗HIV作用的蛋白酶抑制剂阿扎那韦 (Atazanavir)是目前世界上主要的抗艾滋病药物。1998年，美国百时美施贵宝公司开发出 了阿扎那韦的商品药一硫酸阿扎那韦，该药物在2003年6月经美国FDA批准上市，这也是 全球首个每日一次给药的蛋白酶抑制剂，其主要与其他抗逆转录病毒药物联用治疗HIV病 毒，中国也于2007年4月批准其上市，商品名称锐艾妥' (3S) _3_ (叔丁氧幾基）氛基-1-氣_4_苯基-(2R) - 丁醇（I )是制备阿扎那韦的 关键中间体，可由氯醇（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮（II)不对称还 原获得。还原法又可分为化学法和微生物法，化学法需要制备手性化学催化剂，制备工序繁 琐且通常环境污染大。相对于化学法而言，酶催化转化法具有"反应条件温和、转化率高、易 工业化放大"等优点，符合绿色可持续发展的要求。 ，?ι Γ"'? ? .文丄.1...丄 Λ ，· o it V α ， ο w cl H H I O 0Η I η Codexis (W02011005527A2)及苏州汉酶（CN103468757A)均直接将游离酶及游离 的辅酶应用在阿扎那韦中间体（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的 合成中，羰基还原酶及辅酶均不能重复利用，辅酶价格昂贵，成本较高。 因此，通过生物法合成（3S) _3_ (叔丁氧幾基）氛基-1-氣_4_苯基-(2R) - 丁醇 仍具有改进的空间。在已有的报道中，还未见有将羰基还原酶与辅酶共固定化用于制备阿 扎那韦中间体（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为现有生物法合成（3S)-3_(叔丁氧羰基）氨 基_1 _氯_4_苯基-(2R) - 丁醇成本过尚、效率过低，而提尚生物法合成（3S) _3_ (叔丁氧幾 基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇的效率、降低其生产的成本为本专利技术的目的。 为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为： 以（3S)_3_(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2- 丁酮为底物，以羰基还原酶与辅 酶为催化剂，在缓冲液、助溶剂和共底物存在的体系中催化合成（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨 基-1-氯-4-苯基-2- 丁醇，并将羰基还原酶和辅酶共固定化于经过修饰后的磁性介孔材 料上。 其中，对于修饰后的磁性介孔材料应理解为，该材料为共固定化酶的载体，而且该 材料通过改性，具有磁性的物性。 在一个优选的实施方案中，以SBA-15、MCM-41、MCM-48之一为介孔材料，特别优选 SBA-15 ;再通过介孔材料表面的羟基与磁性材料形成配位键获得磁性修饰的介孔材料；并 用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES)修饰带有磁性的介孔材料使其表面带有氨基，示意图见 图1。其中，介孔材料优选平均孔径为2-50 nm，比表面积为500-1500 m2/g。 在一个优选的实施方案中，修饰获得带有磁性的介孔材料的具体步骤为：（1)将 介孔材料加入到含有（NH 4)2Fe(SO4)2. 6H20、NH4Fe(SO4)2. 12H20的水溶液中，用氨水调节pH 至11~12,40-70°C搅拌，获得含有磁性的介孔材料；（2)将步骤（1)中获得的磁性介孔材料 加入至乙醇水溶液中，在氩气保护下搅拌，加入冰醋酸至pH维持在3. 0-5. 0,向体系中加入 3_氨丙基三乙氧基硅烷（APTES)，50-80°C搅拌24-36 h，分离获得固体，即得修饰后的磁性 介孔材料。 在本专利技术所述的方法中，还包括了共底物和助溶剂，其中，共底物是指现有技术中 为了降低生产成本，设计的辅酶循环体系，助溶剂是为了提高底物的分散效果；在该体系中 共底物优选异丙醇，助溶剂优选甲苯。 在本专利技术所述的方法中，所用催化剂为氧化还原酶与辅酶，其中，氧化还原酶为现 有氧化还原酶中的任一一种，只要其可以实现底物的非对称氧化还原即可，如在本专利技术中 优选海洋新鞘氨醇杆菌羰基还原酶；辅酶为NAD/NADH或NADP/NADPH。 在本专利技术中，共固定化的方法在于，将辅酶加入到含羰基还原酶的pH为6. 0-7. 0 的磷酸盐缓冲液中，4°C静置0.2-2 h ;然后加入修饰后的磁性介孔材料，100-150 rpm，25°C 温浴2-8 h，得悬浮液；磁性吸附，去上清，磁性固体用生理盐水洗涤，重复2-4次，得固体即 为羰基还原酶与辅酶共固定化酶体系；获得的固定化酶体系可经过冷冻干燥后，4°C保存。 在获得催化剂以后，可将该催化剂在共底物、助溶剂、缓冲体系存在的情况下 与底物（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2- 丁酮接触，即可催化合成产物 (3S) _3_ (叔丁氧幾基）氛基-1-氣_4_苯基_2_ 丁醇。 在优选的方案中，底物初始浓度控制为50-200 mg/ml ;助溶剂用量为总反应体积 的5-20% ;共固定化酶、异丙醇、底物的投料质量比为0. 05-0. 1:0. 3-0. 5:1 ;辅酶与羰基还 原酶的质量比为1:5-20。 在优选的实施步骤中，获得羰基还原酶与辅酶共固定化酶体系后，将底物 (3S) -3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2- 丁酮、助溶剂、异丙醇、共固定化酶及三乙 醇胺缓冲液（pH 8. 0-8. 5)加入到反应器中，100-150 rpm搅拌，30-40°C保温反应，HPLC 检测，转化率>99%，反应结束；并通过磁性吸附反应液中回收共固定化酶体系；并获得产物 (3S) _3_ (叔丁氧幾基）氨基-1-氯_4_苯基-(2R) - 丁醇。 本专利技术的有益效果在于： 采用修饰后的磁性介孔材料共固定化羰基还原酶及辅酶催化合成（3S)-3-(叔丁氧羰 基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇，采用简单的磁性吸附即可回收利用羰基还原酶及辅 酶，即简化了产品的分离纯化过程又使共固定化酶回收利用率高，更获得了共固定化辅酶 再生体系，提高辅酶再生效率，降低了辅酶的用量，从而大幅度降低生产成本，具有广阔的 应用前景。【附图说明】 图1为磁性修饰的介孔材料固定化酶的模拟流程图； 图2为实施例4中反应24 h后的HPLC谱图； 图3为实施例4中反应48 h后的HPLC谱图； 图4为实施例5中反应24 h后的HPLC谱图； 图5为实施例5中反应48 h后的HPLC谱图； 图6为（3S) _3_(叔丁氧幾基）氨基-1-氯_4_苯基_2_ 丁酮、（3S) _3_(叔丁氧幾基） 氨基-1-氯-4-苯基-(2R)- 丁醇及甲苯的标准品的HPLC谱图。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本 专利技术的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。 本专利技术所涉及的生物酶及其他试本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种催化合成阿扎那韦中间体的方法，以(3S)‑3‑(叔丁氧羰基)氨基‑1‑氯‑4‑苯基‑2‑丁酮为底物，以羰基还原酶与辅酶为催化剂，在缓冲液、助溶剂和共底物存在的体系中催化合成(3S)‑3‑(叔丁氧羰基)氨基‑1‑氯‑4‑苯基‑2‑丁醇，其特征在于，所述羰基还原酶和辅酶共固定化于经过修饰后的磁性介孔材料上。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，唐苏苏，江凌，徐晴，徐娴，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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