不含选择性标志的克隆的非人类动物制造技术

本发明专利技术提供了非人类动物的经过遗传修饰的体细胞，其经过工程改造以含有可自切除的重组酶表达盒，所述重组酶表达盒含有可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因。本发明专利技术提供了用于产生不含选择性标志基因和重组酶基因的经过遗传修饰的、克隆的非人类动物的组合物和方法，其中将包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的可自切除的重组酶基因的靶向构筑体引入分化的体细胞中。将体细胞的经过遗传修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中。然后在试管内培养人工产生的受精卵直至囊胚胚胎期，并且随后将所述受精卵植入代孕母体的子宫中以形成不含选择性标志和重组酶基因的经过遗传修饰的、克隆的非人类动物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】不含选择性标志的克隆的非人类动物相关申请的交叉引用本申请是2012年11月28日提交的US 61/730，771的非临时申请，US 61/730, 771出于所有目的以全文引用的方式并入。
本专利技术提供了不含选择性标志基因和重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物。本专利技术提供了非人类动物的分化的体细胞，其经过遗传工程改造以含有可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞中而不在分化的体细胞中表达。本专利技术提供了用于产生不含选择性标志和位点特异性重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物的组合物和方法。
技术介绍
遗传修饰技术，例如转基因、敲入、敲除、插入诱变以及缺失，不可避免地需要在宿主基因组中插入选择性标志基因以确认成功的遗传修饰。然而，保留在宿主基因组中的选择性标志基因在已经确认了成功的遗传修饰之后就变得多余并且对于来源于含有选择性标志的动物的产物的使用可能引起安全问题。出于这些原因，已经作出许多努力以在遗传修饰之后从宿主细胞或宿主动物中去除选择性标志和重组酶基因。举例来说，经由例如显微注射、转染或通过使用病毒粒子转导将重组酶基因引入ES细胞或受精卵子中，以去除侧接有重组位点(例如，1xP或FRT)的选择性标志基因。或者，将携带选择盒的动物育种为表达位点特异性重组酶的缺失品系以达到相同的效果。然而，这些技术具有许多缺点，包括在ES细胞中低水平的转染效率；由于延长的试管内培养所致的ES细胞多能性下降；以及需要附加的人力和财政资源用于额外的育种步骤。因此，需要用于从经过遗传修饰的动物中有效地去除选择性标志和重组酶基因的组合物和方法。
技术实现思路
提供了用于产生不含选择性标志基因和位点特异性重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物的组合物和方法。提供了不含选择性标志基因和位点特异性重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物，例如小型猪和母牛，其中经过遗传修饰的和克隆的非人类动物的基因组已经从体细胞(例如，成纤维细胞)中转移，这种体细胞经过工程改造以包含可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒含有可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因。ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶在未分化的多能干细胞中，例如在囊胚期胚胎的内细胞团中的ES细胞(其中ES细胞特异性转录因子被表达并且有活性)中转录，而不在分化的体细胞中转录。因此，在遗传修饰期间已经引入的选择性标志基因和重组酶基因可以在克隆胚胎发育期间从多能干细胞的基因组中去除。提供了非人类动物的分化的体细胞，其经过遗传修饰以含有可自切除的重组酶表达构筑体，其中这些体细胞包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种构筑体上游和下游侧接有重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得重组酶基因可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞(例如，ES细胞)中而不在分化的体细胞中表达。通过将分化的体细胞的经过遗传修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中或转移至多能干细胞(其中ES细胞特异性转录因子被表达并且有活性)中，选择性标志和重组酶基因可以从发育中的克隆胚胎中的多能干细胞中去除，或从任何多能干细胞中去除，包括重编程为多能(例如，诱导多能(iPS细胞))的体细胞。提供了产生不含选择性标志基因和重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物的方法，其中这种方法包括:(a)将核酸构筑体引入非人类动物的分化的体细胞中以产生经过遗传修饰的基因组；(b)将(a)的经过遗传修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中；(C)融合并活化(b)的卵母细胞以形成人工受精卵；(d)在试管内培养(C)的人工受精卵直至受精卵发育至囊胚胚胎期；以及(e)将(d)的囊胚植入代孕母体的子宫中以形成不含选择性标志基因和位点特异性重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的非人类动物，其中这种核酸构筑体包含可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种重组酶表达盒上游和下游侧接有重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得位点特异性重组酶可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞中而不在分化的体细胞中转录。因此，将分化的体细胞的经过遗传修饰的基因组转移至无核的宿主卵母细胞中并且使人工产生的受精卵发育成胚胎之后，选择性标志和重组酶基因就从发育中的克隆胚胎中的多能干细胞(其中ES细胞特异性转录因子被表达并且有活性)的基因组中去除。以这种方式，本专利技术可以避免去除选择性标志和重组酶基因所需的ES细胞的操纵或任何额外的育种步骤。在多种实施方案中，核酸构筑体是靶向构筑体。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲除等位基因。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲入等位基因。在一个实施方案中，核酸构筑体包含转基因。提供了产生不含选择性标志基因和重组酶基因的非人类动物的经过遗传修饰的和克隆的多能干细胞的方法，其包括:(a)将核酸构筑体引入非人类动物的分化的体细胞中以产生经过遗传修饰的基因组；以及(b)将(a)的经过遗传修饰的基因组转移至多能干细胞中以产生不含选择性标志基因和重组酶基因的经过遗传修饰的和克隆的多能干细胞，其中这种核酸构筑体包含可自切除的重组酶表达盒，这种重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种重组酶表达盒上游和下游侧接有重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得位点特异性重组酶可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能ES细胞中而不在分化的体细胞中转录。在多种实施方案中，核酸构筑体是靶向构筑体。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲除等位基因。在一个实施方案中，靶向构筑体包含敲入等位基因。在一个实施方案中，核酸构筑体包含转基因。通过将分化的体细胞的经过遗传修饰的基因组转移至多能干细胞或重编程为多能的任何体细胞(其中ES细胞特异性转录因子有活性)中，可以从多能干细胞的基因组中去除侧接有重组位点的选择性标志和重组酶基因。在一个方面，提供了非人类动物的分化的体细胞，其经过工程改造以含有可自切除的重组酶表达盒，其中这种可自切除的重组酶表达盒包含可操作地连接至ES细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中这种重组酶表达盒上游和下游侧接有第一和第二重组位点，这些重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得选择性标志基因和重组酶基因可以在位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中这种ES细胞特异性启动子驱使位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞中而不在分化的体细胞中转录。在一个实施方案中，分化的体细胞选自由以下组成的群组:皮肤细胞、血细胞、神经细胞、肌细胞、骨细胞、肝细胞以及脂肪细胞。在一个实施方案中，分化的体细胞是成纤维细胞。在一个实施方案中，成纤维细胞来源于选自由以下组成的群组的非人类动物:小鼠、大鼠、兔、禽类、母牛、猪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非人类动物的经过遗传修饰的体细胞，其包含可自切除的重组酶表达盒，所述重组酶表达盒具有可操作地连接至胚胎干(ES)细胞特异性启动子的位点特异性重组酶基因，其中所述位点特异性重组酶盒上游和下游侧接有第一和第二重组位点，所述重组位点关于彼此在相同方向上定向以使得所述盒可以在所述位点特异性重组酶存在下被切除，并且其中所述ES细胞特异性启动子驱使所述位点特异性重组酶基因在未分化的多能干细胞中而不在所述经过遗传修饰的体细胞中转录。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·C·龚，K·V·莱，D·M·瓦伦泽拉，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US