本发明专利技术公开了温度敏感型载体pBBR1MCS‑2‑Ts3及其应用。本发明专利技术所提供的温度敏感型载体pBBR1MCS‑2‑Ts3，构建重组载体的方法，是将SEQ ID No.1的第1557‑2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组载体；目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A3)的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：所述A3)为将SEQ ID No.2第86位的Arg突变为Cys。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中温度敏感型载体PBBR1MCS-2-TS3及其应用。
技术介绍
把一段有用的目的DNA片段通过DNA重组技术，送进受体细胞中去进行复制和表 达的工具叫载体（Vector)。质粒是重组DNA技术中常用的载体，质粒存在于许多细菌以及 酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。一个理想的载体 大致应有下列一些特性：（1)分子量小、多拷贝、松弛控制型；（2)具有多种常用的限制性内 切酶的单切点；（3)能插入较大的外源DNA片段；(4)具有遗传标记，便于鉴定和筛选；（5) 对宿主细胞无害。 宽宿主质粒pBBRlMCS-2是应用性很广的载体，该质粒由pBBRl质粒改造而来。 pBBRl 质粒来源于革兰氏阴性菌 Bordetella bronchiseptica S87 (Antoine R and Locht C. Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from Gram-positive organisms. Mol Microbiol. 1992, 6 (13) : 1785-1799)。pBBRlMCS-2 含有一 个卡那霉素（kan)抗性筛选标记，它的大小仅有5145bp，这些特性使得该质粒适用于DNA克 隆、蛋白表达，广泛用于革兰氏阴性菌的分子操作。 温度敏感型质粒载体可以方便的控制质粒在宿主中的存在。当温度比较低时，质 粒可以存在宿主中，而当温度提高后，温度敏感型质粒载体将丢失或整合到染色体上。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何构建温度敏感型载体。 为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了构建重组载体的方法。 本专利技术所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法1，是将SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No. 1的其 他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体，将该重组载体命名为pBBRlMCS-2-Ts3 ; 所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No. 2所示的蛋白质进行A3)的改 造、保持SEQ ID No. 2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质得到的蛋白质，即所述目的 基因表达盒编码的蛋白质为SEQ ID No. 8所示的蛋白质；A3)为将SEQ ID No. 2第86位的 Arg突变为Cys。 上述方法1中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No. 1的第 1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行B3)的改造、保持SEQ ID No. 1的第1794-2456位 核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子；B3)为将SEQ ID No. 1第 2049位的C突变为T。 其中，SEQ ID No. 1由5145个核苷酸组成，SEQ ID No. 1的第1794-2456位核苷酸 为rep的编码基因，编码SEQ ID No. 2所示的rep蛋白。 上述方法1中，所述目的基因表达盒的序列可为SEQ ID No. 7。 其中，SEQ ID No. 7的第238-900位编码SEQ ID No. 8所示的蛋白质。 上述方法1中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为将SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子进行如下C2)、C3)和C4)这三种中至少一种的 改造、保持SEQ ID No. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变 得到的DNA分子： C2)如下 C21)和 / 或 C22): C21)将 SEQ ID No. 1 第 1732 位的 A 突变为 G ; C22)将 SEQ ID No. 1 第 1780 位的 G 突变为 T ; C3)如下 C31)和 / 或 C32): C31)将 SEQ ID No. 1 第 1747 位的 C 突变为 T ; C32)将 SEQ ID No. 1 第 1776 位的 T 突变为 A ; C4)将 SEQ ID No. 1 第 1751 位的 T 突变为 A ; 所述目的基因表达盒中终止所述目的基因表达的终止子为SEQ ID No. 1的第 2457-2526位所示的DNA分子。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了构建重组载体的方法。 本专利技术所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法2,是将SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No. 1的其 他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体； 所述基因表达盒中的基因编码的蛋白质为将SEQ ID No. 2所不的蛋白质进行所述 A3)和下述A4)的改造、保持SEQ ID No. 2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质得到的蛋 白质： A4)如下 A41)和 / 或 A42): A41)将 SEQ ID No. 2 第 25 位的 Lys 突变为 Glu ; A42)将 SEQ ID No. 2 第 146 位的 Ile 突变为 Val。 上述方法2中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No. 1的第 1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行所述B3)和下述M)的改造、保持SEQ ID No. 1的 第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子： B4)如下 B41)和 / 或 B42): B41)将 SEQ ID No. 1 第 1866 位的 A 突变为 G ; B42)将 SEQ ID No. 1 第 2229 位的 A 突变为 G。 上述方法2中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为将SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子进行所述C2)、所述C3)和所述C4)这三种中至 少一种的改造、保持SEQ ID No. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷 酸均不变得到的DNA分子； 所述基因表达盒中终止所述基因表达的终止子为SEQ ID No. 1的第2457-2526位 所示的DNA分子。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了由所述方法1或所述方法2构建的重组载 体。 为解决上述技术问题，本专利技术还提供了含有所述重组载体的重组微生物或重组细 胞系。 所述重组微生物具体可为细菌、酵母、藻和真菌。其中，所述细菌可为大肠杆 菌或类球红细菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Escherichia coli T1、大肠杆菌 Escherichia coli DH5a、大肠杆菌 Escherichia coli BW25113 或大肠杆菌 Escherichia coli S17-1。所述类球红细菌具体可为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4.1。 所述重组细胞系不包括繁殖材料。 为解本文档来自技高网...
【技术保护点】
构建重组载体的方法，是将SEQ ID No.1的第1557‑2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体；所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A3)的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质：所述所述A3)为将SEQ ID No.2第86位的Arg突变为Cys。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄建忠，江贤章，周芬，刘洪娇，祁峰，张明亮，陶勇，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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