可提升甘油代谢的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术提出一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含一λ噬菌体PR启动子及一Trc启动子，其中λ噬菌体PR启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因及dhaKLM基因操纵组的表达，而Trc启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。本发明专利技术更利用此菌株衍生成一种可抵抗粗甘油的菌株、与一种可生产D型乳酸的菌株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术关于一种利用基因工程技术构建的菌株，且特别涉及一种可提升甘油代谢 的菌株、以及此菌株的应用。
技术介绍
当今全球环保意识当道，生质柴油便顺此潮流迅速发展，台湾更于2010年起全面 推动B2生质柴油。生质柴油的制造还伴随副产物的产生，鉴于生质柴油的发展，副产物的 数量亦急剧上升，于是产生大量待处理的废弃物。副产物中的甘油（为与后文提及的"纯净 的甘油"区别，特称之为"粗甘油"）因与其它物质混合，如甲醇、动植物脂肪、或盐类，须经 过精制来得到纯净的甘油，纯净的甘油始有经济价值，可用于化妆品、药品、或其它应用。目 前，粗甘油的精制大多是仰赖与添加的化学物质反应，甚至可能须于高温下作用，以分离出 纯净的甘油。生质柴油虽然诉求环保与低污染，但粗甘油的精制却需要如此不环保的过程， 这与生质柴油的诉求背道而驰。 生物科技是二十一世纪发展的重点产业之一，其核心是在利用生物材料替代化学 物质。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli)因生长快速、培养基配方简单、且发酵操作容 易，为常见的生物材料之一。除此之外，大肠杆菌能代谢多种不同的碳源，如醣类或甘油，已 广泛取代与其等效的化学物质。然而，就粗甘油而言，因其所含的物质会对菌株构成逆境环 境，从而抑制菌株的生长与稳定性，甚至降低菌株的甘油代谢。
技术实现思路
本专利技术的第一构想关于一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含一 λ噬菌体Pk启动子、及一 Trc启动子。λ噬菌体Pk启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调 控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的表达，而Trc启动 子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。 本专利技术的第二构想关于一种可抵抗粗甘油的菌株，其属于大肠杆菌，且为利用一 含以下步骤的方法制得的：培养上一构想的菌株于一第一培养液内；以及培养上一构想的 菌株于一第二培养液内，第二培养液的粗甘油浓度高于第一培养液的粗甘油浓度。 本专利技术的第三构想关于一种可生产D型乳酸的菌株，其属于大肠杆菌，且为剔除 前一构想的菌株染色体上的Pta基因、adhE基因、frdA基因、mgsA基因、pflB基因 、tdcDE 基因操纵组、PflEF基因操纵组、及did基因，并插入乳酸菌D-Idh基因至前一构想的菌株 染色体而制得的。【附图说明】 图1为大肠杆菌的甘油代谢的生化途径图，图中符号说明为：?，代表活化基因的 表达；_〇，代表抑制基因的表达。 图2为质粒pLoxKm-PR的图谱，图中缩写说明为：Ap，抗氨苄青霉素基因 (ampicillin) ;flori，噬菌体 fl 复制起始点；PR promoter，λ 噬菌体？!^启动子；RE, Lox 位；EM7promoter，细菌EM7启动子；Neo (Km)，抗新霉素基因（抗卡纳霉素基因）；LE，Lox位； ColElori,大肠杆菌ColEl复制起始点。 图3为质粒pTH19Cre_Cs的图谱，图中缩写说明为：Cm，抗氯霉素基因； pSClOlori，pSClOl复制起始点；Cre，编码Cre蛋白的基因 ；BAD promoter，BAD启动 子；Operator 11+12,操纵子 11+12 ;CAP site，CAP 结合位；Operatorl，操纵子 01 ;araC promoter，AraC启动子；Operator 02,操纵子02 ;ara C，编码AraC蛋白的基因。 图4为质粒pLoxKm-Trc的图谱，图中缩写说明为：Ap，抗氨节青霉素基因 (ampicillin) 噬菌体 Π 复制起始点；Trc promoter, Trc 启动子；RE, Lox 位； EM7promoter,细菌EM7启动子；Neo (Km)，抗新霉素基因（抗卡纳霉素基因）；LE, Lox位； ColElori,大肠杆菌ColEl复制起始点。 图5为使用分光光度计测量含菌株BLA-13的培养液在每次继代培养时菌体浓度 的结果，以显示菌株在每次继代培养的生长情况。 图6为使用高效率液相层析测量含菌株BLA-13的培养液于每次继代培养时甘油 浓度的结果，以显示菌株于每次继代培养的甘油代谢情况。 图7为菌株BLA-13及菌株BLA-13-G于培养后的生长情况与粗甘油代谢情况，图 中曲线说明为：实心方框的曲线，含菌株BLA-13的培养液的菌体浓度；空心方框的曲线，含 菌株BLA-13-G的培养液的菌体浓度；实心圆框的曲线，含菌株BLA-13的培养液的粗甘油浓 度；空心圆框的曲线，含菌株BLA-13-G的培养液的粗甘油浓度。 图8为菌株BLA-13-G9于发酵后的的生长情况、粗甘油代谢情况、及D型乳酸 生产情况，图中曲线说明为：实心圆框的曲线，含菌株BLA-13-G9的发酵液的菌体浓度； 实心三角框的曲线，含菌株BLA-13-G9的发酵液的粗甘油浓度；实心方框的曲线，含菌株 BLA-13-G9的发酵液的D型乳酸浓度。 具体实施例 如图1，大肠杆菌的甘油代谢的生化途径主要分为：有氧代谢与无氧代谢。在有氧 代谢途径中，菌株是将甘油先转化成甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，G3P)，接着将 甘油-3-磷酸转化为二轻丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate, DHAP);然而，在无氧代 谢途径中，其是将甘油先转化为二羟基丙酮（dihydroxyacetone，DHA)，然后将二羟基丙酮 转化为二羟丙酮磷酸。而，有氧代谢途径与无氧代谢途径中的上述步骤的差异意味着涉及 这些不同步骤的酵素的基因可能与氧气的调控有关。换言之，gldA基因、或dhaKLM基因操 纵组的启动子可能为一缺氧（hypoxia)有关的调控组件，glpK基因、或glpD基因的启动子 可能为一有氧（hyperoxia)有关的调控组件。 根据上述，本专利技术人推测若利用基因工程技术将一与氧气无关的启动子取代此二 代谢途径中不同步骤的酵素的基因启动子，则菌株不再受有氧或无氧的影响，可同时活化 甘油的有氧代谢途径与无氧代谢途径，双管齐下地提升甘油代谢。 于是，本专利技术的第一实施方式提出一种可提升甘油代谢的菌株。此菌株属于大肠 杆菌，且含有一 λ噬菌体Pk启动子、及一 Trc启动子；其中，λ噬菌体Pk启动子为镶嵌于 菌株的染色体上，以调控染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵 组的表达，而Trc启动子为镶嵌于菌株的染色体上，以调控染色体上的glpF基因的表达。前 述基因名称的全名，如下：dhaKLM，二羟基丙酮激酶（dihydroxyacetone kinase);gldA，甘 油去氢!酶（glycerol dehydrogenase) ;glpD，甘油 _3_ 憐酸去氧酶（glycerol-3-phosphate dehydrogenase) ;glpF，传送甘油的辅助蛋白（glycerol uptake facilitator protein); glpK，甘油激酶（glycerolkinase )。 在本实施方式中，λ噬菌体？,启动子可镶嵌于glpK基因、glpD基因、gldA基因、 及dhaKLM基因操本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可提升甘油代谢的菌株，其属于大肠杆菌，且包含：一λ噬菌体PR启动子，其镶嵌于该菌株的染色体上，以调控该染色体上的glpK基因、glpD基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的表达；以及一Trc启动子，其镶嵌于该菌株的染色体上，以调控该染色体上的glpF基因的表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云鹏，王祉雯，姜中人，
申请(专利权)人：逢甲大学，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71