一种纳米钻石靶向药物的制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法和应用。将转铁蛋白Tf溶于PBS缓冲溶液中，再加入DOX反应得到Tf-DOX复合物；将羧基化的纳米钻石和Tf-DOX复合物反应得到纳米钻石靶向药物ND-(Tf-DOX)。该靶向药物与HepG2作用，用低温、不同抑制剂和游离Tf处理细胞，表明其具有能量依赖；用人正常HEK293做对比，研究细胞对其吸收，表明其具有靶向选择性；用人HepG2和人HeLa做对比，MTT法检测其细胞毒性，表明其对癌细胞具有靶向抗肿瘤效应和选择性；以荷瘤小鼠为模型，研究其在体内的抑制肿瘤效应，表明其能抑制肿瘤并相对阿霉素具有较低毒副作用。其可在制备靶向抗肿瘤药物中应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法和应用。将转铁蛋白Tf溶于PBS缓冲溶液中，再加入DOX反应得到Tf-DOX复合物；将羧基化的纳米钻石和Tf-DOX复合物反应得到纳米钻石靶向药物ND-(Tf-DOX)。该靶向药物与HepG2作用，用低温、不同抑制剂和游离Tf处理细胞，表明其具有能量依赖；用人正常HEK293做对比，研究细胞对其吸收，表明其具有靶向选择性；用人HepG2和人HeLa做对比，MTT法检测其细胞毒性，表明其对癌细胞具有靶向抗肿瘤效应和选择性；以荷瘤小鼠为模型，研究其在体内的抑制肿瘤效应，表明其能抑制肿瘤并相对阿霉素具有较低毒副作用。其可在制备靶向抗肿瘤药物中应用。【专利说明】一种纳米钻石靶向药物的制备方法和应用
本专利技术涉及靶向纳米药物，具体涉及一种转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物的制 备方法，以及该方法制备的药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
目前用于癌症治疗的手段主要有手术、放疗、化疗和生物治疗等，但各种治疗手段 都给患者带来极大的痛苦，而且对中晚期癌症病人作用不明显，因此研究有效且低伤害的 靶向治疗方法尤为迫切。近年来随着纳米科学与生命科学、医学等学科的有机结合，纳米生 物医学已经成为引人瞩目的新兴交叉学科之一。 由于纳米颗粒的尺寸效应，多适用于纳米载体，基于转铁蛋白-转铁蛋白受体高 亲和力作用，可将转铁蛋白与药物载体偶联，通过与肿瘤细胞表面转铁蛋白受体相互作用 特性来实现抗癌药物的主动靶向输送。基于这个策略，量子点、金纳米颗粒和纳米钻石等纳 米颗粒与转铁蛋白偶联，然后与转铁蛋白受体过量表达的肿瘤细胞系相互作用证实其具有 靶向输送特性。可见靶向载体制备的重要性，但靶向载体材料是否能真正实现靶向运输药 物是人们急切关注的焦点，据我们了解，目前这样的报道很少见。由于纳米钻石具有特殊的 生物相容性好、无毒性、尺寸小与化学性质稳定和表面易修饰等优点，在生物医学领域的应 用潜力引起了人们广泛关注。因此，我们展开了针对转铁蛋白偶联纳米钻石且携带化疗药 物制成的纳米药物系统是否能实现靶向输送药物目的的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有主动靶向特性的转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向 药物的制备方法，以及该方法制备的纳米钻石靶向药物在抗肿瘤药物中的应用。 本专利技术提供的一种转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法，包括如下步 骤： (1)按每lmg转铁蛋白溶于每lmL硼酸缓冲溶液（PBS)中，接着按转铁蛋白（Tf) 与阿霉素（D0X)质量比100 : 6-10加入D0X，摇匀，室温下避光，在摇匀仪上反应过夜得到 Tf-DOX复合物； (2)称取干燥的羧基化的纳米钻石，按每毫克羧基化的纳米钻石加入1-1. 5ml的 MES(0. 1M，pH6. 00)缓冲溶液中，超声分散形成悬浊液，再按每毫克羧基化的纳米钻石中加 入0. 2mg EDC与0. 3mg NHS，室温搅拌反应6h，以15000rpm离心5min，除去上清液，继而用 pH 7.4 PBS缓冲液洗涤两次，弃去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；把活化羧基的 纳米钻石沉淀物重新分散到PBS缓冲液溶液（pH7. 4)中，超声分散形成悬浊液，加入制备的 Tf-DOX复合物，室温下避光在摇匀仪上反应12h ;然后于15000rpm离心5min，用PBS缓冲 液清洗沉淀直至上清液无色为止，制得转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物ND- (Tf-DOX)，冷 藏；ND-(Tf-DOX)粒径大小约为235nm。 与现有技术相比本专利技术的有益效果：本专利技术选用的纳米钻石材料具有生物相容 性好、无毒、化学性质稳定、表面易修饰等诸多优点。制备的ND-(Tf-DOX)纳米药物，经体 外肿瘤细胞转运机制表明ND-(Tf-DOX)具有能量依赖，是由网格蛋白决定、转铁蛋白受 体介导机制进入细胞；用人肝癌细胞（HepG2)和人正常胚胎肾细胞（HEK293)做对比，表 明ND-(Tf-DOX)纳米药物进入细胞具有选择性；用人肝癌细胞（HepG2)和人宫颈癌细胞 (HeLa)做对比，MTT法检测ND-(Tf-DOX)纳米药物对细胞活性的影响，表明该药物对癌细胞 具有靶向抗肿瘤效应且具有选择性。以荷瘤小鼠为模型，将上述纳米药物通过尾部静脉注 射至小鼠体内，检测其治疗肿瘤的效果（以阿霉素作为对照），定期测量实验小鼠的体重和 肿瘤体积，证实了纳米材料ND-(Tf-DOX)在生物体内的高生物兼容性，通过瘤体变化率对 比说明ND-(Tf-DOX)药物注射组的瘤体增长较D0X组缓慢；实验后期处死动物，测得的各 器官指数证实了 ND-(Tf-DOX)药物对小鼠肝脏和脾脏的毒副作用明显低于传统化疗药物 D0X。上述实验结果揭示了 ND-(Tf-DOX)纳米药物可在制备抗肿瘤药物中应用。 【专利附图】【附图说明】 图1A低温及不同抑制剂条件下细胞对ND-(Tf-DOX)纳米药物吸收的影响 图1B不同游离转铁蛋白浓度条件，细胞内吞ND-(Tf-DOX)纳米药物差异 图1C IfepG2和HEK293细胞摄取ND-(Tf-DOX)纳米药物的差异 图2 ND-(Tf-DOX)纳米药物对H印G2、HeLa细胞活性的影响 图3A不同药物组对肿瘤抑制的代表示意图（治疗期为31天） 图3B不同药物组对肿瘤体积变化率抑制柱状图，（PBS组（n = 5)，D0X组 (100mg/20g mice) (n = 5)和 ND-(Tf-DOX)组（100mg of D0X equivalent per 20g mice) (n = 5)，n =小鼠只数。通过静脉注射，每7天一次。 图3C不同药物组对荷瘤小鼠体重的影响（药物组和剂量同图3B) 图3D不同药物组对荷瘤小鼠各器官指数的影响（药物组和剂量同图3B) 【具体实施方式】 载体为纳米钻石（ND，元素六，直径大约140nm, Ireland)。 阿霉素（D0X)是盐酸多柔比星，分子式为C27H29N0 n ?HC1，分子量为579. 99,深圳万 乐药业有限公司，规格按C27H29N〇n ? HC1计算为10mg。 人转铁蛋白（Tf，分子量80000)为Sigma公司。 实施例1 : (1)转铁蛋白-阿霉素（Tf-D0X)复合物的制备 准确称取2mgTf，加入2mL PBS(pH7.4)缓冲溶液，摇匀，再向其中加入200iig D0X，室温下，在摇匀仪上反应过夜以制备Tf-D0X复合物室温下避光，在摇匀仪上反应过夜 以制备Tf-D0X复合物。 (2)纳米钻石_(转铁蛋白-阿霉素）纳米药物的制备 称取干燥的2mg羧基化的纳米钻石，接着加入2. 0ml的MES (0. 1M，pH6. 00)缓冲 溶液，超声分散30min形成悬浊液，再加入0. 4mg EDC与0. 6mg NHS，室温搅拌反应6h，以 15000rpm离心5min，除去上清液，继续用pH 7. 4PBS缓冲液洗涤两次，弃去上清液，得到活 化羧基的纳米钻石沉淀物；把活化羧基的纳米钻石沉淀物重新分散到PBS缓冲液溶液中， 超声分散形成悬浊本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)按每1mg转铁蛋白Tf溶于1mL PBS缓冲溶液中，接着按Tf与DOX质量比100︰6‑10加入DOX，摇匀，室温下避光，在摇匀仪上反应过夜得到Tf‑DOX复合物；(2)称取干燥的羧基化的纳米钻石，按每毫克羧基化的纳米钻石加入1‑1.5ml浓度为0.1M pH6.00的MES缓冲溶液中，超声分散形成悬浊液，再按每毫克羧基化的纳米钻石中加入0.2mg EDC与0.3mg NHS，室温搅拌反应6h，以15000rpm离心5min，除去上清液，继而用pH 7.4 PBS缓冲液洗涤两次，弃去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；把活化羧基的纳米钻石沉淀物重新分散到pH7.4的PBS缓冲液溶液中，超声分散形成悬浊液，加入制备的Tf‑DOX复合物，室温下避光在摇匀仪上反应12h；然后于15000rpm离心5min，用PBS缓冲液清洗沉淀直至上清液无色为止，制得转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物ND‑(Tf‑DOX)，冷藏。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李英奇，王志琴，田志梅，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14