本发明专利技术涉及一种鳆发光杆菌荧光素酶、编码该酶的基因及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供一种鳆发光杆菌荧光素酶基因，该基因可在大肠杆菌中实现高效的表达并用于NADH的定量检测，为代替发光细菌双酶体系的检测提供可能。本发明专利技术通过导入鳆发光杆菌荧光素酶基因LuxAB，优化条件使外源荧光素酶蛋白在大肠杆菌中实现高效的表达，并借助大肠杆菌RosettaDE3本身含有高活性的FMN-NADH氧化还原酶，实现了重组大肠杆菌双酶体外的发光，并应用于NADH的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物技术 领域。
技术介绍
发光细菌是是一类在正常条件下能够发射可见光的非致病性细菌。其发光机理属 在荧光素酶和氧化还原酶共同参与下的酶促氧化反应。FMN-NADH氧化还原酶对NADH具有 特异性，在NADH存在的条件下，将FMN还原为FMNH 2，为发光酶促反应提供底物，荧光素酶催 化FMNH2&八碳以上长链脂肪醛（RCHO)发生氧化还原反应，同时释放最大发光强度在波长 450_490nm的蓝绿光。 细菌荧光素酶：FMN_NADH氧化还原酶体外发光双酶体系的发光强度与其必需底 物NADH的浓度在一定范围内呈正相关关系。NADH广泛存在于一切微生物体内，在特定代 谢时期的微生物细胞中NADH含量相对稳定，且不同活细菌胞内NADH含量基本一致；而细菌 死亡后，在胞内酶作用下，NADH将很快被分解。因此NADH可以作为具有代谢活性细胞的指 示物。目前利用鳆发光杆菌初步纯化的荧光素酶_FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系检测 NADH，发光强度在1 X X l(T8m〇l/L之间具有较好的线性关系，且NADH最低检测浓度 可达到IX lOAiol/L。基于发光细菌双酶体系对NADH有较高的灵敏度和专一性，使得发光 细菌双酶体系用于微生物检测成为可能。但是目前利用鳆发光杆菌双酶体系用于NADH进 行检测，也存在着酶液制备量少，成本较高的缺陷。
技术实现思路
本专利技术提供一种鳆发光杆菌荧光素酶基因，该基因可在大肠杆菌中实现高效的表 达并用于NADH的定量检测，为代替发光细菌双酶体系的检测提供可能。 一种鳆发光杆菌荧光素酶基因，其具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。 含有所述基因的重组表达载体。 含有所述重组表达载体的微生物。 一种鳆发光杆菌荧光素酶，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。 所述鳆发光杆菌荧光素酶在NADH的定量检测方面的应用。 一种所述鳆发光杆菌荧光素酶基因进行NADH定量检测的方法，该方法包括如下 步骤： (1)采用分子克隆技术将所述基因导入到大肠杆菌R〇settaDE3中，诱导表达荧光 素酶； (2)验证FMN :NADH氧化还原酶存在于大肠杆菌RosettaDE3中； (3)重组大肠杆菌粗酶液制备：提取重组大肠杆菌RosettaDE3胞内产物，得到粗 酶制剂，采用该粗酶制剂进行NADH的定量检测；该粗酶制剂中含有荧光素酶和FMN :NADH 氧化还原酶。NADH的定量检测包括NADH标准液配制和对样品进行发光检测。NADH标准液 配制，绘制NADH浓度与荧光素酶和FMN :NADH氧化还原酶双酶体系发光强度的标准曲线。 对样品进行发光检测。进一步的，所述的发光检测是在微弱发光仪中于450-490nm下测量 体系的发光值，最佳为474nm。 本专利技术通过导入鳆发光杆菌荧光素酶基因LuxAB，优化条件使外源荧光素酶蛋白 在大肠杆菌中实现高效的表达，并借助大肠杆菌R〇settaDE3本身含有高活性的FMN-NADH 氧化还原酶，实现了重组大肠杆菌双酶体外的发光，并应用于NADH的检测。 重组大肠杆菌RosettaDE3作为克隆表达外源基因的常见菌株，其本身含有 FMN-NADH氧化还原酶，通过导入荧光素酶基因，使重组蛋白荧光素酶得到最佳表达，从而使 得重组大肠杆菌体外发光体系代替发光细菌的检测成为可能。利用重组大肠杆菌体外发光 体系用于NADH的定量检测，检测NADH标准溶液的线性关系和发光细菌体外发光体系一样 好，相比之前发光细菌体外发光体系的检测成本大大降低，且制备量扩大。【附图说明】 图1是重组大肠杆菌荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶双酶体外发光体系的发光性 能； 图2是重组大肠杆菌荧光素酶-FMN:NADH氧化还原酶体外发光体系检测NADH的 标准曲线。【具体实施方式】 下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落 入本专利技术保护范围。 在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等 均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常 规方法。 本专利技术所述鳆发光杆菌荧光素酶基因，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，该 基因提取自鳆发光杆菌（Photobacterium leiognathi)YL菌株，该菌株是由中国海洋大学 食品安全实验室自行分离，现保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M206139。 实施例1荧光素酶基因LuxAB在大肠杆菌RosettaDE3中的克隆与表达 将鳆发光杆菌中编码荧光素酶的LuxAB基因进行PCR扩增，并经限制性内切酶 BamHI和Xhol酶切后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（BPI)进行回收；与酶切回收后的 质粒pET_28a(+)进行连接反应，再将连接产物导入到表达宿主菌大肠杆菌RosettaDE3中， 待测序正确后，用〇.5mMIPTG进行10h诱导表达，并经Ni Sepharose TM 6Fast Flow填料 进行纯化得到具有活性的重组荧光素酶蛋白。 实施例2大肠杆菌RosettaDE3中FMN :NADH的活性检测与验证 大肠杆菌RosettaDE3经超声破碎、离心后提取到的粗酶液，从中取1ml酶液，一 次性快速加入底物FMN-Na 0. 5yL(10mM)和NADH 300 yL(0. 14mM)，进行吸光值测定。吸 光值检测利用紫外荧光分光光度计扫描测定，检测条件：设置波长340nm，加入溶液或试剂 后，进行时间扫描，在60s内吸光值的下降可反映出FMN:NADH氧化还原酶活力的大小。 FMN :NADH氧化还原酶在大肠杆菌rosettaDE3的活力测定结果见表1。 表 1【主权项】1. 一种鳆发光杆菌荧光素酶基因，其具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。2. 含有权利要求1所述基因的重组表达载体。3. 含有权利要求2所述重组表达载体的微生物。4. 一种鳆发光杆菌荧光素酶，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。5. 权利要求4所述鳆发光杆菌荧光素酶在NADH的定量检测方面的应用。6. -种利用权利要求1所述鳆发光杆菌荧光素酶基因进行NADH定量检测的方法，其特 征是该方法包括如下步骤： (1) 采用分子克隆技术将权利要求1所述基因导入到大肠杆菌R〇settaDE3中，诱导表 达荧光素酶； (2) 验证FMN :NADH氧化还原酶存在于大肠杆菌RosettaDE3中； (3) 重组大肠杆菌粗酶液制备：提取重组大肠杆菌RosettaDE3胞内产物，得到粗酶制 剂，采用该粗酶制剂进行NADH的定量检测。7. 根据权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于：定量检测中采用微弱发光测量 仪在450-490nm下测量体系的发光值。【专利摘要】本专利技术涉及，属于生物
本专利技术提供一种鳆发光杆菌荧光素酶基因，该基因可在大肠杆菌中实现高效的表达并用于NADH的定量检测，为代替发光细菌双酶体系的检测提供可能。本专利技术通过导入鳆发光杆菌荧光素酶基因LuxAB，优化条件使本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鳆发光杆菌荧光素酶基因，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王静雪，林洪，玄冠华，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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