本发明专利技术涉及一种木聚糖酶XynRBM26及其编码基因、重组载体和重组菌。本发明专利技术提供了一种木聚糖酶XynRBM26，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术以山毛榉木聚糖为底物的木聚糖酶XynRBM26最适pH为5.5，最适温度为45℃，在反应体系中加入5M的NaCl仍然具有86％的酶活，酶经2M NaCl在37℃下处理1h，活性高达120％；该酶能有效地水解燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖，而不能水解羧甲基纤维素钠、昆布多糖和β-葡聚糖、微晶纤维素、p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，可广泛应用于饲料、食品和生物燃料等行业。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物和基因工程
，尤其涉及的是一种木聚糖酶XynRBM26 及其编码基因。
技术介绍
木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的主要组成成分，其完全水解需要木聚糖酶 和木糖苷酶等多种酶的协同作用，木聚糖酶包括内切-I，4_f3-D-木聚糖酶（endo-1， 4_β -D_xylanase，EC 3. 2. 1. 8)和 a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶（a -L-arabinofuranosidase， EC 3· 2.I.55)等（Collins et al. FEMS Microbiol Rev，2005,29:3-23)。内切-1， 4- β -D-木聚糖酶能水解木聚糖主链的β -I，4糖苷键，是木聚糖降解过程中发挥最主要作 用的酶。由于木聚糖酶具有降解植物木聚糖的作用，被广泛应用于食品、饲料、酿酒、造纸、 麻类脱胶和燃料生产等工业领域。 植食性动物胃肠道中存在丰富的与木质纤维素降解有关的多种酶类，但不同动 物之间存在差异（Hess et al.Science，2011，331:463-467;Dai et al.PLoS 0ne，2012， 7:e40430)。近年来，研宄者通过微生物分离培养和宏基因组学等方法从天牛胃肠道、奶牛 瘤胃、山羊瘤胃等动物中获取了多种木聚糖酶（Zhou et al. J Ind Microbiol Biotechnol， 2011,38:523-530 ；Cheng et al. J Agric Food Chem,2012,60:12516-12524 ；ffang et al. Bioresour Technol，2011，102:3330-3336)。漬金丝猴（Rhinopithecus bieti)是典型 的植食性灵长类动物，由于摄食种类和物种的差异，其胃肠道中可能蕴含有不同于其它动 物的新的微生物木聚糖酶基因资源，但到目前为止，还未见滇金丝猴胃肠道微生物来源相 关酶基因的报道。 木聚糖酶来源比较广泛，在细菌、真菌、陆地植物组织中都存在（Collins et al. FEMS Microbiol Rev，2005, 29:3-23)，其中微生物主要来源于芽孢杆菌属（Bacillus)、 曲霉属（Aspergillus)、里氏木霉属（Trichoderma)等，然而来自Massilia的木聚糖 酶尚未见报道。不同菌属来源的木聚糖酶酶学性质差异较大（Kimura et al.Biosci Biotechnol Biochem，2000,64:1230-1237 ;Gessesse et al. Appl Environ Microbiol， 1998,64:3533-3535)，因此研宄鉴定不同来源的木聚糖酶对其在不同领域的应用具有重要 意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种木聚糖酶。 本专利技术的再一目的是提供编码上述木聚糖酶的基因。 本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组表达载体。 本专利技术的另一目的是提供用所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的重组菌株。 本专利技术从滇金丝猴粪便中分离到Massilia sp. RBM26,通过基因组测序，获得第10 家族的木聚糖酶编码基因，并将其转入大肠杆菌进行异源表达和重组酶的酶学特性分析， 发现获得的木聚糖酶XynRBM26在高浓度NaCl下仍然具有催化活性，可应用于高盐食品和 海产品加工及其它高盐环境生物
，且本专利技术中的木聚糖酶来源于动物胃肠道，因 此其性质具有进一步应用于饲料等领域的潜力。 本专利技术所述木聚糖酶XynRBM26可得自Massilia sp. RBM26,其编码基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。 本专利技术所述木聚糖酶XynRBM26的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，共383个氨基 酸，其理论分子量为43. 17kDa。 本专利技术的木聚糖酶XynRBM26的最适pH值为5. 5，在ρΗ5· 0-7. 0之间可以保持90 % 以上的酶活性；在pH5. 0-10. 0的缓冲液处理lh，酶活力剩余82%以上；最适反应温度为 45°C，在37°C、45°C和50°C下处理lh，剩余酶活分别为95. 6%、81. 2%和59. 7% ;反应体系 中0. 5-1. 5M的NaCl对酶活影响较小，在5M时仍可以保持86%的活性；经0. 5-5M的NaCl 在37°C下处理lh，发现0.5-3. 5M的NaCl可提高酶活；在反应体系中加入10% (v/v)的乙 醇进行酶促反应，可保持50 %的酶活性，酶经3. 0-15. 0% (v/v)的乙醇在37°C下处理lh， 该酶仍能保持80%左右的酶活性；在pH5. 5及45°C下该酶对0. 5% (w/v)的燕麦木聚糖、 山毛榉木聚糖能有效地水解，而不能水解羧甲基纤维素钠、昆布多糖和β -葡聚糖、微晶纤 维素、p-nitrophenyl- β -D_xylopyranoside〇 本专利技术通过基因组测序的方法克隆了木聚糖酶的编码基因 XynRBM26,其全长为 1152bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。 本专利技术还提供了包含上述木聚糖酶基因 XynRBM26的重组载体，优选为 pEasy-E2-XynRBM26。将本专利技术的木聚糖酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达 调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，将本专利技术木聚糖酶基因和表达载 体pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2_XynRBM26。 本专利技术还提供了包含上述木聚糖酶基因 XynRBM26的重组菌株，优选所述菌株为 大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21 (DE3)/XynRBM26。 本专利技术制备木聚糖酶XynRBM26的方法按以下步骤进行： 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶基因 XynRBM26表达； 3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XynRBM26。 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3) /XynRBM26。 本专利技术提供了一个新的木聚糖酶基因，其编码的木聚糖酶最适pH为5. 5,最适温 度为45°C，在反应体系中加入5M的NaCl仍然具有86%的酶活，酶经2M NaCl在37°C下处 理lh，活性高达120%;该酶能有效地水解燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖，而不能水解羧甲基纤 维素钠、昆布多糖和β _葡聚糖、微晶纤维素、P_nitrophenyl- β -D-xylopyranoside。以上 性质表明本专利技术的木聚糖酶作为一种新型的酶制剂，可广泛应用于饲料、食品和生物燃料 等行业。【附图说明】 图1 :在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶XynRBM26的SDS-PAGE分析，其中，1 : 500mM咪挫洗脱亲和于Nickel-NTA Agarose中的重组XynRBM26 ;M :蛋白质Marker。 图2 :纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的pH活性。 图3 :纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的pH稳定性。 图4 :纯化的重组木聚糖酶X本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种木聚糖酶的编码基因XynRBM26，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许波，戴利铭，黄遵锡，李俊俊，唐湘华，周峻沛，杨云娟，丁俊美，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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