针对丙型肝炎病毒的嵌合疫苗抗原制造技术

本发明专利技术描述了针对丙型肝炎病毒(HCV)的嵌合疫苗抗原，其包含从所述病毒的各种不同抗原中选择出的区域，所述区域以确定的顺序位于该多肽内。此外，所述嵌合抗原可以包括人工设计的对于辅助性T淋巴细胞来说特异的表位。所述嵌合抗原，以及所得的疫苗组合物，可应用于医学和制药工业领域，并且具有针对HCV的预防和/或治疗用途。本发明专利技术的疫苗组合物以最少的组分产生针对所述病毒的各种不同抗原的强有力且广谱的免疫应答。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及医学和制药工业领域，特别地涉及针对丙型肝炎病毒（HCV)的嵌合抗 原和包含所述嵌合抗原的疫苗组合物的开发。在本专利技术中，使用最少数目的组分，因为所述 嵌合抗原能够诱导增强的且多样的针对HCV的抗原的免疫应答，这通过精确选择对于所述 抗原来说特异的区域和包括对于CD4+ T淋巴细胞来说特异的人工表位来实现。 现有技术 HCV 感染全世界人口 的大约 3% (Williams R·，H印atology, 2006, 44:521-526)。 大多数被感染的个体行进至慢性（Amoroso P等人，J Hepatol, 1998, 28:939-944)。 丙型肝炎是慢性肝损伤、肝硬化、肝功能衰竭和肝癌的主要原因之一（Hoofnagle JH.，H印atology，2002, 36(5Suppl I) :S21-S29)。目前，它在第一世界国家中是肝移植的主 要原因。另外，HCV感染与肝外表现（尤其是例如II型冷球蛋白血症、膜性增生性肾小球肾 炎、迟发性皮肤卟啉症）有关。不存在针对该病毒的预防性疫苗，并且在使用中的基于PEG 化的干扰素（IFN) +利巴韦林的组合的抗病毒治疗在少于50%的病例中是有效的。此外，这 些治疗引起多重不良事件（Ghany MG 等人，!fepatology, 2009, 49 (4) : 1335-74)。 HCV是属于黄病毒科丙型肝炎病毒属的一种病毒。它是有包膜的病毒，其病 毒颗粒具有50至70nm的大小，并且与极低密度脂蛋白（VLDL)相联合（Popescu Cl和 Dubuisson, J. Biol Cell, 2009, 102 (1):63-74)。病毒基因组为大约 9. 6kb 的正极性的单 链核糖核酸（RNA)。该基因组编码病毒多蛋白，其以共翻译和翻译后方式被加工成至少 10种病毒蛋白：核心、EU E2、p7(结构蛋白），和非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、 NS5B (Bartenschlager R和 Lohmann V·，2000,J Gen Virol, 81:1631-48)〇 对于获得针对HCV的有效疫苗，存在若干重大的障碍。该病原体是RNA病毒，其可 以快速突变以适应宿主环境。这对世界上鉴定出的多种病毒分离物的序列的高度多样性 做出了贡献。已描述了六种主要的基因型，其在核苷酸序列水平上可以达到相差直至30% (Simmonds P·，J Hepatol, 1999, 31Suppl 1:54-60)。最大的异质性存在于 HCV 的 E2 蛋白 的高变区中，其中恰好存在对于中和抗体的可能的靶表位。事实上，HCV作为异质的病毒分 子群体在生物体中循环，这是称为"准种"的现象（Simmonds P.，J Gen Virol, 2004, 85 (Pt 11) :3173-88)。已证明突变是一种对由宿主发展出的特异性免疫应答（体液的以及细胞 的）进行逃逸的方式。 应当强调，HCV在具有免疫能力的个体中造成持续感染，尽管存在活跃的免疫应答 (Lechmann等人，Semin Liver Dis, 2000, 20, 211-226)。目前，已阐明了数种对于免疫系统 的病毒效应，其通过促进不相关的免疫应答的发展和阻止对于病毒去除来说真正有效的应 答的发展而有助于病毒的持续存在。无论在先天免疫中还是在获得性免疫中，均看到这些 效应（Grakoui A 等人，Science, 2003, 302 (5645) : 659-62)。存在这样的证据：针对 HCV 的 无效免疫应答不仅不能达到去除该病原体，而且还有助于肝损伤。 迄今为止，还没有完全确定与针对HCV感染的保护或病毒澄清相关联的免疫学参 数。然而，估计针对各种不同病毒抗原的强力且持续的细胞免疫应答的诱导是特别重要的 (Lechmann 等人，Semin Liver Dis, 2000, 20, 211-226)。在被 HCV 慢性感染的个体中，对于 特异性T淋巴细胞的应答的影响是特别引人注意的。几种机制看起来对于该效应做出了贡 献，其中之一是调节性T细胞的作用。 为了开发针对HCV的疫苗，已研宄了几乎所有的免疫接种策略。在这些策略中 强调了重组蛋白、合成肽、病毒样颗粒、裸脱氧核糖核酸（DNA)和重组病毒的使用。作 为针对HCV的疫苗候选物的靶标，已评价了所有的病毒抗原。大多数的疫苗候选物依 然集中于在动物模型中的免疫原性研宄的阶段，虽然目前几个候选物处于临床阶段，其 中经证明是安全的和具有免疫原性的，但还没有临床影响的证明（Alvarez-Lajonchere L，Duefias-Carrera S·，Int Rev Immunol, 2012, 31 (3) :223-42) 〇 基于蛋白质亚基的疫苗的开发是对于HCV所评价的首要策略之一。所提出的基 于HCV的结构区域的抗原的策略中的一些已在动物模型中取得了有限的针对该病毒的 保护。用由El和Ε2蛋白形成的寡聚体进行免疫接种的黑猩猩的情况就是这样的。对 七只黑猩猩进行了疫苗接种，其中五只得到保护，和两只得病，但被治愈而未进展为慢性 期（Choo 等人，Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91，1294-1298)。已将所述保护作用与 能够抑制E2与人细胞结合的抗体（Ab)的存在相关联（Rosa等人，Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93, 1759-1763)。 作为同源二聚体，纯化出了来自基因型Ib分离物的重组El蛋白（Maertens等 人，Acta Gastroenterol Belg, 2000, 63, 203)。两只被HCV慢性感染的黑猩猩接受9个剂 量的50 μ g重组El蛋白。该疫苗接种改善了肝组织学，招致了病毒抗原从肝脏中消失，和降 低了丙氨酸氨基转移酶（ALT)水平。尽管在血清中的病毒RNA水平在治疗期间未改变，但 在结束治疗后肝脏炎症和病毒抗原重新出现。观察到在高水平的针对El的抗体与肝损伤 的减少之间的联系（Maertens 等人，Acta Gastroenterol Belg, 2000, 63, 203)。甚至在人 中评价了在氧化铝中配制的HCV的El的蛋白变体。该疫苗候选物经证明是安全的和具有 免疫原性的，从而能够诱导抗体应答以及特异性的淋巴组织增生性应答（Nevens F.等人，H 印atology，2003, 38 (5) : 1289-96)。然而，该疫苗候选物的施用没有达到在临床上影响HCV感 染，因为未实现在患者中的病毒澄清，也未观察到肝脏疾病的显著改善。用完整的蛋白质亚 基进行免疫接种的分析研宄具有在某些情况下不诱导强烈的细胞应答的缺点。此外，该分 析研宄还冒这样的风险：包括了在以各种不同水平影响由该病原体诱导的抗-HCV免疫应 答的各种不同机制中所牵涉的区域（Grakoui A等人，Science, 2003, 302(5645) :659-62)。 基于包含对于T淋巴细胞来说特异的HCV表位的合成肽的混合物的两个疫苗候选 物也已达到了在人中的临床评价阶段（Yutani等人，Cancer Sci, 2009本文档来自技高网...

【技术保护点】
针对丙型肝炎病毒(HCV)的嵌合疫苗抗原，其以下列顺序包含：a)由HCV多蛋白的E2区域(氨基酸408‑540)组成的第一区段，b)由HCV多蛋白的E1区域(氨基酸190‑222)组成的第二区段，和c)由HCV多蛋白的核心区域(氨基酸1‑50)组成的第三区段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·杜纳斯卡雷拉，D·阿圭拉诺利加，Y·阿玛多卡尼扎勒斯，L·阿尔瓦勒兹拉雍彻尔庞斯德里昂，G·玛蒂内兹多纳托，S·冈萨雷斯布兰科，
申请(专利权)人：遗传工程与生物技术中心，
类型：发明
国别省市：古巴;CU