一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库技术

本申请公开了一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库。具体公开了运用本申请构建的数据库对菜豆晕疫病菌、菜豆细菌性萎蔫病菌、豌豆细菌性疫病菌、大豆细菌性疫病、大豆细菌性褐斑病、大豆斑疹病菌和菜豆细菌性疫病等豆类重要植物病原菌的七重特异性检测方法。本申请的多重检测方法，能同时检测豆类上七种病原细菌，提高了检测速度，为口岸检验检疫等部门提供了一种快速、灵敏、高通量的分析检测方法，可以缩短传统检测时间，提高通关速度，降低企业成本；同时对豆类作物安全生产、引种和外销提供技术保障，提高进境豆类作物及其产品疫情截获率，提高防范外来有害生物入侵能力，具有重要实用性和技术性。

【技术实现步骤摘要】
一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库
本申请涉及豆类细菌性病害检测领域，特别是涉及一种豆类植物病原细菌的多重检测方法，及该检测方法所采用的数据库。
技术介绍
据中国海关总署数据显示，2012年中国大豆进口量为5838万吨，2013年进口量为6338万吨，2014年进口量约为7070万吨，可见中国大豆对外依存度超过80％。豆类上重要植物病原细菌主要有大豆细菌性疫病(Pseudomonassavastanoipv.glycinea)、大豆细菌性褐斑病(Pseudomonassyringaepv.syringae)、大豆斑疹病菌(Xanthomonasaxonopodispv.glycines)、菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciens)、菜豆晕疫病菌(Pseudomonassavastanoipv.phaseolicola)、菜豆细菌性疫病(Xanthomonasaxonopodispv.phaseoli)和豌豆细菌性疫病菌(Pseudomonassyringaepv.pisi)。其中菜豆细菌性萎蔫病菌、菜豆晕疫病菌和豌豆细菌性疫病菌是我国进境植物检疫性有害生物。随着豆类进口量的不断增加，豆类细菌性病害传入我国的风险也随之加大。目前，植物病原细菌的传统检测鉴定检测方法主要是依据分离培养、菌落形态、生理生化反应、血清学反应等手段。但这些方法通常取决于病原细菌的生长代谢过程，一般需要24-48小时，而且这些方法通常操作复杂，灵敏度比较低，不能满足口岸植物检疫的快速通关要求。随着分子生物学技术的发展，基于核酸的基因序列分析、实时荧光PCR等各种检测技术成为植物细菌鉴定的首选方法，因其快速、灵敏度高等特点，使得植物细菌的快速检测和病害诊断成为现实；但存在检测成本高，以及特异性探针引物的选择困难复杂等问题，而且有时很难达到对细菌种、菌株水平的鉴定。因此，建立一种快速、灵敏、高通量的分析方法用于检测豆类植物病原细菌具有重要的意义，也是我国口岸检疫部门急需解决的问题。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)是近几年发展起来的一种用于微生物检测方法，其基本原理是将微生物微量样品与小分子基质混合，在样品盘上形成共结晶，然后在脉冲激光作用下，基质吸收激光能量跃迁到激发态，使样品电离后从离子源被传送到质量分析器内测定其分子量。样品的离子质荷比(m/z)与离子在飞行管内的飞行速度成正比，不同m/z值的样品离子到达检测器的时间不同，从而得到不同m/z值的峰图。目前，MALDI-TOFMS技术以蛋白质为靶标分子已广泛应用于鉴定志贺氏菌(Shigellaspp.)、沙门氏菌(Salmonellaspp.)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)等食源性致病细菌，由于该技术具有快速、操作简单、高通量以及质量范围广等特点，也逐渐被引入植物病原菌的鉴定研究中。但是，目前尚没有特别针对豆类细菌性病害的多重检测方法及相应的标准蛋白质指纹图谱数据库。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种豆类植物病原细菌的多重检测方法及数据库。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请公开了一种豆类植物病原细菌的多重检测方法，该方法包括以下步骤，(1)在无菌条件下取受检细菌1-2mg，用无菌水进行至少一次洗涤后，离心弃上清，再用无菌水:无水乙醇体积比为1:3的溶液洗涤至少一次，离心弃上清，然后加入浓度70％的甲酸和/或浓度100％的乙腈，混匀，离心留取上清液，即受检细菌蛋白液；(2)分别取1μL受检细菌蛋白液和1μL蛋白标准样品点在质谱靶芯片上，室温晾干，再滴加1μL基质溶液覆盖在受检细菌蛋白液和蛋白标准样品上，室温晾干；每个受检细菌蛋白液至少重复4个检测点；(3)采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对受检细菌蛋白液进行检测，每个检测点至少采集5张蛋白质峰图，将至少20张蛋白质峰图叠加制成受检细菌质谱图；(4)将步骤(3)获得的受检细菌质谱图与数据库比对，与数据库的比对结果Log(score)≥2.5时，判断为阳性；其中，数据库为本申请构建的包含豆类上七种植物病原细菌的标准蛋白质指纹图谱。需要说明的是，本申请的多重检测方法，采用本申请特别针对豆类上七种植物病原细菌构建的数据库，能够实现同时对豆类上七种重要的植物病原细菌进行特异性检测。还需要说明的是，上述质荷比的值是一组相对稳定的值，并且这些值是至少20张图叠加后出现概率为90％以上的数值，本领域技术人员可以理解，在不同实验条件下，在这些数值的基础上进行的小数点值的变化，或者说在1‰允许误差范围内个别值进行的数值变化，也属于本申请的保护范围。还需要说明的是，其中Log(score)是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对待检样品进行检测分析后输出的一个判别参数，而2.5的数值是构建检测方法时，根据多个阳性样品统计得出的，不同的数据库该数值是不同的；也就是说，在对待检样品进行判断时，只有Log(score)≥2.5，其检测结果才具有意义，否则即便检测结果与七个峰图之一很近似，也不能认定为待检样品中含有峰图对应的病原细菌。优选的，基质溶液的溶剂为10％三氟乙酸:无菌去离子水:乙腈按体积比1:1:2混合而成。优选的，基质溶液的溶质为α-氰基-4-羟基肉桂酸。本申请的另一面公开了一种蛋白质指纹图谱数据库，该数据库包含豆类上七种植物病原细菌的七个标准蛋白质指纹图谱，蛋白指纹图谱分别由七种植物病原细菌的多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成；第一个标准蛋白质指纹图谱为菜豆晕疫病菌的特征峰图，第二个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性疫病的特征峰图，第三个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性褐斑病的特征峰图，第四个标准蛋白质指纹图谱为豌豆细菌性疫病菌的特征峰图，第五个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性疫病的特征峰图，第六个标准蛋白质指纹图谱为大豆斑疹病菌的特征峰图，七个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性萎蔫病菌的特征峰图。需要说明的是，本申请的数据库是采用豆类上七种重要病原细菌的标准菌株为基础制备的，具有比较好的稳定性和特异性，为豆类上七种重要病原细菌的多重检测奠定了基础。优选的，数据库适用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。需要说明的是，本申请的数据库是利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪构建的，因此，该数据库可以很好的适用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；但是，数据库与检测结果的比对，实际上是通过质谱仪中的其中一个分析软件实现的，也就是说，在这个分析软件可以单独使用的情况下，或者，有其他的分析软件可以读取并分析标准蛋白质指纹图谱的情况下，本申请的数据库也可以单独用于其他分析软件或设备。本申请的另一面还公开了蛋白质指纹图谱数据库在豆类细菌性病害的检测或鉴定中的应用。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：本申请的多重检测方法，能够同时检测豆类上的七种重要植物病原细菌，大大提高了检验检疫速度；尤其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种豆类植物病原细菌的多重检测方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)在无菌条件下取受检细菌1‑2mg，用无菌水进行至少一次洗涤后，离心弃上清，再用无菌水:无水乙醇体积比为1:3的溶液洗涤至少一次，离心弃上清，然后加入浓度70％的甲酸和/或浓度100％的乙腈，混匀，离心留取上清液，即受检细菌蛋白液；(2)分别取1μL受检细菌蛋白液和1μL蛋白标准样品点在质谱靶芯片上，室温晾干，再滴加1μL基质溶液覆盖在受检细菌蛋白液和蛋白标准样品上，室温晾干；每个受检细菌蛋白液至少重复4个检测点；(3)采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对受检细菌蛋白液进行检测，每个检测点至少采集5张蛋白质峰图，将至少20张蛋白质峰图叠加制成受检细菌质谱图；(4)将步骤(3)获得的受检细菌质谱图与数据库比对，与数据库的比对结果Log(score)≥2.5时，判断为阳性；所述数据库中包含豆类上七种植物病原细菌的七个标准蛋白质指纹图谱，所述蛋白指纹图谱由植物病原细菌的多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成；第一个标准蛋白质指纹图谱为菜豆晕疫病菌的特征峰图，构成第一个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2561.9、3329.9、3587.3、3617.9、4127.0、4369.6、4433.7、4740.2、4834.9、4939.9、5083.6、5123.3、5672.9、5826.2、5972.9、6000.5、6341.2、6651.3、6876.0、7169.8、7234.4、7262.7、7559.2、7876.0、8251.7、8430.1、8801.8、9665.9、9875.4、10198.7、10234.1、11336.5；第二个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性疫病的特征峰图，构成第二个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2563.4、3330.8、3588.2、3620.5、3922.9、4129.2、4435.2、4857.2、4941.2、5126.1、5666.9、5976.1、6003.6、6344.1、6653.9、6879.0、7173.2、7238.5、7265.6、7876.7、8255.9、8829.3、9670.3、9877.9、9882.4、10203.5、11332.7；第三个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性褐斑病的特征峰图，构成第三个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2533.8、3551.2、3588.9、3620.3、3728.7、4129.0、4435.2、4835.2、4942.9、5125.1、5975.3、6006.1、6639.1、6879.1、7173.2、7237.9、7560.2、7670.9、8255.7、9671.8、9797.0、9880.9、10203.0、10235.2、11343.3；第四个标准蛋白质指纹图谱为豌豆细菌性疫病菌的特征峰图，构成第四个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2562.7、3329.5、3620.9、3475.2、3588.4、3620.9、4128.2、4435.1、4940.8、5124.5、5973.7、6001.8、6354.7、6652.2、6877.6、7171.7、7237.5、7611.6、8252.1、9135.5、9502.3、9668.5、9877.4、10200.7、11338.8；第五个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性疫病的特征峰图，构成第五个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：4572.3、4630.1、5854.5、5885.4、6099.7、7558.2、8114.2、8269.3、8269.3、8407.2、8735.9、9162.9、9322.3、9595.6、9783.6、9820.4、10586.6、11940.2、12408.5、13561.4；第六个标准蛋白质指纹图谱为大豆斑疹病菌的特征峰图，构成第六个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2485.4、2641.2、2728.4、2914.1、3061.4、3620.9、3714.4、4244.3、4971.0、5003.8、5374.8、6003.8、6103.0、7079.0、7385.0、8011.3、8484.7、8870.3、9095.4、9662.7、14755.0；第七个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性萎蔫病菌的特征峰图，构成第七个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2583.6、3264.2、3426.5、3535.8、3739.9、3954.0、4146.5、4269.6、4470.4、4584.5、4624.4、4771.7、5166.3、5305.1、5683.4、5724.6、5898.4、652...

【技术特征摘要】
1.一种豆类植物病原细菌的多重检测方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)在无菌条件下取受检细菌1-2mg，用无菌水进行至少一次洗涤后，离心弃上清，再用无菌水:无水乙醇体积比为1:3的溶液洗涤至少一次，离心弃上清，然后加入浓度70％的甲酸和/或浓度100％的乙腈，混匀，离心留取上清液，即受检细菌蛋白液；(2)分别取1μL受检细菌蛋白液和1μL蛋白标准样品点在质谱靶芯片上，室温晾干，再滴加1μL基质溶液覆盖在受检细菌蛋白液和蛋白标准样品上，室温晾干；每个受检细菌蛋白液至少重复4个检测点；(3)采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对受检细菌蛋白液进行检测，每个检测点至少采集5张蛋白质峰图，将至少20张蛋白质峰图叠加制成受检细菌质谱图；(4)将步骤(3)获得的受检细菌质谱图与数据库比对，与数据库的比对结果Log(score)≥2.5时，判断为阳性；所述数据库中包含豆类上七种植物病原细菌的七个标准蛋白质指纹图谱，所述蛋白指纹图谱由植物病原细菌的多个蛋白质的质荷比及其蛋白质波峰强度系数绘制而成；第一个标准蛋白质指纹图谱为菜豆晕疫病菌的特征峰图，构成第一个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2561.9、3329.9、3587.3、3617.9、4127.0、4369.6、4433.7、4740.2、4834.9、4939.9、5083.6、5123.3、5672.9、5826.2、5972.9、6000.5、6341.2、6651.3、6876.0、7169.8、7234.4、7262.7、7559.2、7876.0、8251.7、8430.1、8801.8、9665.9、9875.4、10198.7、10234.1、11336.5；第二个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性疫病的特征峰图，构成第二个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2563.4、3330.8、3588.2、3620.5、3922.9、4129.2、4435.2、4857.2、4941.2、5126.1、5666.9、5976.1、6003.6、6344.1、6653.9、6879.0、7173.2、7238.5、7265.6、7876.7、8255.9、8829.3、9670.3、9877.9、9882.4、10203.5、11332.7；第三个标准蛋白质指纹图谱为大豆细菌性褐斑病的特征峰图，构成第三个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2533.8、3551.2、3588.9、3620.3、3728.7、4129.0、4435.2、4835.2、4942.9、5125.1、5975.3、6006.1、6639.1、6879.1、7173.2、7237.9、7560.2、7670.9、8255.7、9671.8、9797.0、9880.9、10203.0、10235.2、11343.3；第四个标准蛋白质指纹图谱为豌豆细菌性疫病菌的特征峰图，构成第四个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2562.7、3329.5、3620.9、3475.2、3588.4、3620.9、4128.2、4435.1、4940.8、5124.5、5973.7、6001.8、6354.7、6652.2、6877.6、7171.7、7237.5、7611.6、8252.1、9135.5、9502.3、9668.5、9877.4、10200.7、11338.8；第五个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性疫病的特征峰图，构成第五个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：4572.3、4630.1、5854.5、5885.4、6099.7、7558.2、8114.2、8269.3、8269.3、8407.2、8735.9、9162.9、9322.3、9595.6、9783.6、9820.4、10586.6、11940.2、12408.5、13561.4；第六个标准蛋白质指纹图谱为大豆斑疹病菌的特征峰图，构成第六个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2485.4、2641.2、2728.4、2914.1、3061.4、3620.9、3714.4、4244.3、4971.0、5003.8、5374.8、6003.8、6103.0、7079.0、7385.0、8011.3、8484.7、8870.3、9095.4、9662.7、14755.0；第七个标准蛋白质指纹图谱为菜豆细菌性萎蔫病菌的特征峰图，构成第七个标准蛋白质指纹图谱的蛋白质的质荷比分别为：2583.6、3264.2、3426.5、3535.8、3739.9、3954.0、4146.5、4269.6、4470.4、4584.5、4624.4、4771.7、5166.3、5305.1、5683.4、5724.6、5898.4、6525.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯建军，章桂明，龙海，史秀杰，
申请(专利权)人：深圳市检验检疫科学研究院，深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44