一种铁皮石斛的离体保存方法技术

本发明专利技术公开了一种铁皮石斛的离体保存方法，包括铁皮石斛的组培快繁，再利用组培快繁得到的具有4~5片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存，所述的保存培养基为1/2MS+CCC 0.9mg/l +AC 0.45%，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。利用本发明专利技术的方法保存的铁皮石斛的恢复率较高，恢复情况良好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于组织培养
，具体地，涉及铁皮石斛的离体保存方法。
技术介绍
铁皮石斛，为兰科多年生附生草本植物。生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石 上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐一 5°C的低温。石斛可分为黄 草、金钗、马鞭等数十种，铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有 独特的药用价值，以其茎入药，属补益药中的补阴药。野生铁皮石斛的自然繁殖能力低、生 长缓慢，对生长的环境条件要求苛刻。在引种栽培时较难成活，给种质保存与利用带来较大 的困难。因此找出一种种质资源保护的有效新途径，对铁皮石斛资源的修复和再生，防止流 失、退化和灭绝，保障资源的可持续利用具有重要意义。 目前如何妥善保存稀有的种质资源已成为一个急需解决的问题，而组织培养为离 体种质保存提供了最便捷、稳定的手段。 组织培养的关键技术是培养基及其培养条件，同一属不同种的植物其培养条件也 不尽相同，因此，对同一个属的不同种的植物组织培养条件的研宄也十分必要。
技术实现思路
针对现状，本专利技术提供，利用组织培养技术对其进 行离体繁殖，通过采用合适的保存培养基对其进行离体保存，可以大大提高种质资源的利 用率。 为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案： ，包括如下步骤： (1)外植体诱导培养:取野外采集的铁皮石斛的茎尖作为外植体，在70%乙醇中浸泡 10~30s，无菌水冲洗2~3次，投入添加2%吐温-20的0. 1%升汞4min，最后用无菌水冲洗2~3 次后切割为〇. 5~1. Ocm长接种在接种培养基上，培养10~14天，顶芽和侧芽分化形成嫩黄绿 色丛生芽；所述培养基的pH值为5. 1，培养温度为24~28° C，光照强度1600~20001χ，光照 时间为12小时/天。 (2)壮苗生根培养:经30~50天，丛生芽长至2~3cm，转入生根培养基培养1个月 后，长成具根和4~6片叶的试管苗；所述培养基的pH值为5. 1，温度为23~27° C，光照强度 3500~42001x，光照时间为12小时/天。 (3)离体保存：将由丛生芽分化产生的具有4~5片叶的试管苗，接种到保存培养基 进行离体保存；所述培养基的pH值为5. 1，温度为15-18° C，光照强度1200~16001x，光照 时间为8小时/天。 前述铁皮石斛的离体保存方法中，步骤（1)中所述的接种培养基为： MS+6-BA1. 2mg/l+NAA0.1 mg/1，培养基中添加2. 5%的蔗糖和0. 4%的琼脂。 前述铁皮石斛的离体保存方法中，步骤（2)中所述的生根培养基为：1/2MS+IAA 1.0 mg/1 +ACL 0%，培养基中添加2. 5%的蔗糖和0. 4%的琼脂。 前述铁皮石斛的离体保存方法中，所述的保存培养基为1/2MS+CCC 0.9mg/l +AC 0. 45%，培养基中添加2. 5%的蔗糖和0. 4%的琼脂。 本专利技术的有益效果： 利用本专利技术的方法可以使种质资源得到长期的保存，并且得到的种苗健壮、成活率高， 可在短期内提供大量铁皮石斛的优质种苗，有效解决了铁皮石斛属种质资源保存及规模化 育苗问题。 本专利技术通过摸索一系列合理的培养基配方和培养条件，实现了使铁皮石斛有效繁 殖的目的，另外，对其保存培养进行了一系列的研宄，通过筛选合适的保存培养基达到本发 明的目的，实现了铁皮石斛的离体保存。使铁皮石斛的规模化工业生产成为可能，具有广泛 的应用前景。 本专利技术在现有技术的基础上进一步改进，其保存时间得以延长，保存效果得以提 尚。 利用本专利技术的方法保存的铁皮石斛的恢复率较高，试管苗恢复情况良好。【附图说明】 图1表示本专利技术光强对铁皮石斛离体保存的影响。 其中，横坐标表示光照强度（Ix)，纵坐标表示保存天数（d)。【具体实施方式】 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 -种铁皮石斛属离体保存方法，通过以下方法实现： 一、铁皮石斛经快速繁殖得培养物： 1、供试材料 采自于浙江天台的铁皮石斛的茎尖。 2、外植体的消毒处理 将选择的茎尖，在70%乙醇中浸泡10~30s，无菌水冲洗2~3次，投入添加2%吐温-20的 0. 1%升采4min，最后用无菌水冲洗2~3次。 3、外植体诱导 将采集到的铁皮石斛茎尖灭菌后切割为0. 5~1. Ocm长的小段，接种在MS+6-BA1. 2mg/ 1+NAA0.1 mg/1培养基上，培养基中添加2. 5%的蔗糖和0. 4%的琼脂。培养10~14天，顶芽 和侧芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；所述培养基的pH值为5. 1，培养温度为24~28° C，光照 强度1600~20001x，光照时间为12小时/天。 4、丛生芽壮苗生根 上述丛生芽经30~50天长至2~3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具根和4~6片 叶的试管苗；所述培养基的pH值为5. 1，温度为23~27° C，光照强度3500~42001x，光照时 间为12小时/天。 5、试管苗移栽 当试管苗至少具有4~5片伸展叶，根系正常，健康，高度为6cm左右时，即可出瓶移栽， 先要经室内炼苗，出瓶时不能折伤叶片和根尖，清除根系上的培养基，分株种植，种植基质 为苔藓：锯末：树皮=3 :2 :4,盖上透光率50%的黑色遮阴网以保持较低光强，2天浇水1次 以保持湿润。栽后放在大棚内，隐蔽度为70%，棚内温度控制在20°C~28°C，注意保湿。7~15 天用1/8MS液，喷施一次，促进幼苗生长。约20天试管苗长出新根，揭开遮阴网，单株移栽 入盆。移栽的成活率可达96%。 二、离体保存 选择上述具有4~5片叶铁皮石斛试管苗为试验材料进行离体保存。 下面对其进行培养基类型、温度、光强、生长抑制剂的筛选，保存天数均以试管苗 存活率为80%进行统计。 1、培养基对铁皮石斛离体保存的影响 将试验材料接种到试验设计MS、1/2MS、1/4MS三种培养基上，接种10瓶，每瓶5株单 芽；培养基中含有25g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5. 1，培养温度20±1°C，光 强16001x，光照8h/d ;结果表明铁皮石斛在1/2MS培养基上保存时间最长，具体结果见表 1〇 表1培养基对铁皮石斛离体保存时间的影响【主权项】1. ，其特征在于，包括如下步骤： (1) 外植体诱导培养:取野外采集的铁皮石斛的茎尖作为外植体，在70%乙醇中浸泡 10~30s，无菌水冲洗2~3次，投入添加2%吐温-20的0. 1%升汞4min，最后用无菌水冲洗2~3 次后切割为〇. 5~1.Ocm长接种在接种培养基上，培养10~14天，顶芽和侧芽分化形成嫩黄绿 色丛生芽；所述培养基的pH值为5. 1，培养温度为24~28° C，光照强度1600~20001X，光照 时间为12小时/天； (2) 壮苗生根培养:经30~50天，丛生芽长至2~3cm，转入生根培养基培养1个月后， 长成具根和4~6片叶的试管苗；所述培养基的pH值为5. 1，温度为23~27° C，光照强度 3500~42001x，光照时间为12小时/天； (3) 离体保存：将由丛生芽分化产生的具有4~5片叶的试管苗，接种到保本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铁皮石斛的离体保存方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）外植体诱导培养：取野外采集的铁皮石斛的茎尖作为外植体，在70%乙醇中浸泡10~30s，无菌水冲洗2~3次，投入添加2%吐温‑20的0.1%升汞4min，最后用无菌水冲洗2~3次后切割为0.5~1.0cm长接种在接种培养基上，培养10~14天，顶芽和侧芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；所述培养基的pH值为5.1，培养温度为24~28°C，光照强度1600~2000lx，光照时间为12小时/天；（2）壮苗生根培养：经30~50天，丛生芽长至2~3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具根和4~6片叶的试管苗；所述培养基的pH值为5.1，温度为23~27°C，光照强度3500~4200lx，光照时间为12小时/天；（3）离体保存：将由丛生芽分化产生的具有4~5片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存；所述培养基的pH值为5.1，温度为15‑18°C，光照强度1200~1600lx，光照时间为8小时/天。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋瑛倩，
申请(专利权)人：常州展华机器人有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32