本发明专利技术公开了一种快速测定山羊乳腺上皮细胞脂肪酸成分的方法，步骤包括：利用细胞刮铲收集细胞；应用超声波破碎细胞并利用硫酸/甲醇溶液进行脂肪酸甲酯化；利用HCl/正己烷溶液进行萃取抽提；利用无水Na2SO4进行脂肪酸样品的干燥处理并用GC-MS进行脂肪酸成分测定。本发明专利技术的方法较传统的脂质提取方法，具有简单，快速，准确的优点，且适合于批量处理。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物样品分析
，具体涉及一种快速测定山羊乳腺上皮细胞脂 肪酸成分的方法。
技术介绍
乳腺是哺乳动物中少数可以重复经历生长，功能分化和退化过程的器官之一，也 是动物转基因技术及乳腺生物反应器等研宄的重要组织，因此明确乳腺的生物学功能具有 重要意义。乳腺上皮细胞是乳腺组织的重要组成部分，对于研宄乳腺的功能具有重要价值， 已成为研宄乳腺功能的重要靶细胞之一。通过测定细胞内脂肪酸成分的变化从而探讨细胞 中脂代谢调控机制是现在研宄乳腺的功能的重要手段，其生成的脂肪酸是乳中脂肪酸的重 要来源，同时，细胞内脂肪酸成分也是细胞内重要的信号分子，通过测定细胞中脂肪酸的成 分的变化来探讨脂肪酸在乳腺内脂质代谢调控网络中的作用具有重要意义。 然而，现在对于脂肪酸提取及测定的报道主要集中在组织及乳中，组织中脂肪酸 的测定主要应用氯仿/甲醇/水系统，然而这种方法毒性较强，且过程较为繁琐，耗时较长。 对于细胞中脂肪酸的提取及测定报道较少，所以获得一种适用于山羊乳腺上皮细胞中脂肪 酸成分的提取及测定分析方法尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是为解决上述现有技术中存在的问题，提供一种适用于山羊乳 腺上皮细胞中脂肪酸成分的提取及测定分析方法。 本专利技术提供的，包括以下步 骤： Al :收集细胞 待细胞培养皿中细胞密度为90%以上时弃去细胞培养液，用PBS缓冲液清洗细 胞，然后向所述细胞培养皿中添加一定量的硫酸/甲醇溶液，然后用细胞刮铲将细胞完全 转移至预先加入一定量的硫酸/甲醇溶液的微量玻璃反应瓶中；所述细胞指山羊乳腺上皮 细胞。用刮取的方法尽可能多的保留了样品内的脂肪酸成分，采用微量玻璃反应瓶则避免 了酯化过程中的泄露情况的发生。 A2:甲酯化处理 将所述微量玻璃反应瓶盖拧紧密封，然后进行超声处理，超声处理后于水浴中放 置一定时间，然后于室温下自然冷却。 A3 :脂肪酸抽提 待冷却至室温后向所述微量玻璃反应瓶中加入I. 5mL~2. 5mL0.1 M的HCl水 溶液，并使用硅化枪头向微量玻璃反应瓶中加入800 yL~I. 5mL正己烷，然后涡旋震荡 30s~Imin震荡后离心。所述加入800~I. 5mL正己烧用较小的容积尽量增大样品的浓 度，同时避免了加入量过大时，后续浓缩过程中造成脂肪酸成分损失而影响测定结果。 A4:成分测定 使用硅化枪头取离心所得上清液并加入至装有无水似2504的2mL硅化离心管中， 然后震荡30s~Imin后静置5~7min，静置后离心，吸取离心所得上清液并加入至玻璃进 样瓶中用于GC-MS分析。 进一步的，上述步骤Al中，所述细胞培养皿的规格为60mm~100mm，所述一定量的 硫酸/甲醇溶液是指500 μ L~I. 5mL2. 5 %硫酸/甲醇溶液；所述2. 5 %硫酸/甲醇溶液指 含硫酸体积百分比为2. 5%的甲醇溶液。 进一步的，上述步骤A2中，所述超声处理的时间为10~20min，所述水浴指80°C 水浴，所述一定时间为60min。 进一步的，上述步骤A3中，向所述微量玻璃反应瓶中加入2mL0.1 M的HCl水溶液。 进一步的，上述步骤A3中，离心的条件为：3000r/min离心5min。 进一步的，上述GC-MS分析的条件如下： 载气：He ; 载气流速：lmL/min ; 进样 口温度：240 °C; 进样量：1 μ L ; 分流比：1:10; 升温程序：40°C保持2min，然后以8°C /min升温至180°C并保持2min，然后以3°C / min升温至240°C并保持IOmin ; 质谱溶剂延迟：5min ; 电离能：70eV ; 质量数范围：35~500amu。 通过与现有技术进行对比分析，本专利技术的有益效果在于：步骤A1，使用了细胞刮 板代替传统的胰酶消化法；使用8mL的微量玻璃反应管代替了常用玻璃管，保证了反应过 程的密封性和安全性，常用的玻璃管易漏气，而且有爆裂的危险；步骤A2,使用0.25%硫 酸/甲醇溶液代替了常用的氢氧化钾/甲醇溶液；使用基于超声波清洗机的超声波裂解法 裂解细胞；硫酸/甲醇溶液能够很好的使游离的脂肪酸和结合态的脂肪酸都能够甲酯化， 而氢氧化钾/甲醇溶液仅适用于游离态的脂肪酸，对于结合态的脂肪酸的甲酯化效果不 佳。使用超声波清洗机可以在密封的环境下进行，如果使用传统的超声波破碎仪，在开放 的环境下则可能导致脂肪酸成分的挥发；步骤A3,使用I. 5mL~2. 5mL0.1 M的HCl溶液和 800 μ L~I. 5mL正己烷进行脂肪酸甲酯的提取；添加 HCl能够保证溶液的酸性条件，有益 于保证脂肪酸成分的真实性，避免了使用水对酸性环境的改变。同时800 μ L~I. 5mL的 添加量可保证溶液的成功分层，又可以最大限度的减少因为过程的繁琐而导致的成分的损 失；本专利技术在收集细胞后直接进行破碎并甲酯化，然后再进行脂肪酸的提取，全过程只使用 一次水相与有机相的分离，较传统的脂质提取方法具有简单，快速，准确的优点，且适合于 批量处理。【附图说明】 图1为本专利技术山羊乳腺上皮细胞脂肪酸测定的GC-MS图。【具体实施方式】 本专利技术提供的，包括以下步 骤： Al :收集细胞 待细胞培养皿中细胞密度为90%以上时弃去细胞培养液，用PBS缓冲液清洗细 胞，然后向所述细胞培养皿中添加一定量的硫酸/甲醇溶液，然后用细胞刮铲将细胞完全 转移至预先加入一定量的硫酸/甲醇溶液的微量玻璃反应瓶中；所述细胞指山羊乳腺上皮 细胞。用刮取的方法尽可能多的保留了样品内的脂肪酸成分，采用微量玻璃反应瓶则避免 了酯化过程中的泄露情况的发生。 A2:甲酯化处理 将所述微量玻璃反应瓶盖拧紧密封，然后进行超声处理，超声处理后于水浴中放 置一定时间，然后于室温下自然冷却。 A3 :脂肪酸抽提 待冷却至室温后向所述微量玻璃反应瓶中加入I. 5mL~2. 5mL0.1 M的HCl水 溶液，并使用硅化枪头向微量玻璃反应瓶中加入800 yL~I. 5mL正己烷，然后涡旋震荡 30s~Imin震荡后离心。所述加入800~I. 5mL正己烧用较小的容积尽量增大样品的浓 度，同时避免了加入量过大时，后续浓缩过程中造成脂肪酸成分损失而影响测定结果。 A4 :成分测定 使用硅化枪头取离心所得上清液并加入至装有无水Na2SOd^ 2mL硅化离心管中， 然后震荡30s~Imin后静置5~7min，静置后离心，吸取离心所得上清液并加入至玻璃进 样瓶中用于GC-MS分析。 进一步的，上述步骤Al中，所述细胞培养皿的规格为60mm~100mm，所述一定量的 硫酸/甲醇溶液是指500 μ L~I. 5mL2. 5 %硫酸/甲醇溶液；所述2. 5 %硫酸/甲醇溶液指 含硫酸体积百分比为2. 5%的甲醇溶液。 进一步的，上述步骤A2中，所述超声处理的时间为10~20min，所述水浴指80°C 水浴，所述一定时间为60min。 进一步的，上述步骤A3中，向所述微量玻璃反应瓶中加入2mL0.1 M的HCl水溶液。 进一步的，上述步骤A3中，离心的条件为：3000r/min离心5min。 进一步的，上述GC-MS分析的条件当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速测定山羊乳腺上皮细胞脂肪酸成分的方法，其特征在于：包括以下步骤：A1：收集细胞待细胞培养皿中细胞密度为90％以上时弃去细胞培养液，用PBS缓冲液清洗细胞，然后向所述细胞培养皿中添加一定量的硫酸/甲醇溶液，然后用细胞刮铲将细胞完全转移至预先加入一定量的硫酸/甲醇溶液的微量玻璃反应瓶中；所述细胞指山羊乳腺上皮细胞；A2：甲酯化处理将所述微量玻璃反应瓶盖拧紧密封，然后进行超声处理，超声处理后于水浴中放置一定时间，然后于室温下自然冷却；A3：脂肪酸抽提待冷却至室温后向所述微量玻璃反应瓶中加入1.5mL～2.5mL0.1M的HCl水溶液，并使用硅化枪头向微量玻璃反应瓶中加入800μL～1.5mL正己烷，然后涡旋震荡30s～1min震荡后离心；A4：成分测定使用硅化枪头取离心所得上清液并加入至装有无水Na2SO4的2mL硅化离心管中，然后震荡30s～1min后静置5～7min，静置后离心，吸取离心所得上清液并加入至玻璃进样瓶中用于GC‑MS分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗军，朱江江，孙雨婷，石恒波，李君，王伟，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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