一种提高无核葡萄杂交胚挽救成苗的方法技术

本发明专利技术属于植物育种技术领域，公开了一种提高无核葡萄杂交胚挽救成苗的方法，该方法在无核葡萄杂交胚败育前，利用摘心与环剥的物理措施促进胚珠与胚的体内发育，确定了二个南方无核葡萄杂交组合的胚败育挽救取样的适宜时间，确定了胚珠培养与胚萌发的培养基添加物、试管苗双芽茎段接种继代与继代培养基添加物等内容。应用本发明专利技术所获得的无核葡萄杂交胚发育率高，胚挽救苗整齐健壮，胚发育率达到了41.7％，成苗率达到了18.3％，继代培养成苗率达到了92％，其中健壮苗率达到81.8％，试管苗移栽成活率达到了97％，大大提高了杂交后代胚挽救成苗的基数，从而能得到更多的无核杂交后代植株群体，提高了南方开展无核葡萄杂交胚挽救成苗率，方法可操作性强、容易掌握。

【技术实现步骤摘要】
一种提高无核葡萄杂交胚挽救成苗的方法
本专利技术涉及植物育种
，尤其涉及一种提高无核葡萄杂交胚挽救成苗的方法。
技术介绍
无核葡萄由于食用方便深受消费者欢迎，在世界鲜食葡萄生产上占有重要地位，美国80％以上的鲜食葡萄是无核品种。但在葡萄育种方面，由于无核葡萄果实没有种子，作为母本无法获得杂交后代植株，长期以来只能利用有核品种作为母本与无核品种进行杂交，但其后代出现无核植株的比率很低，且育种周期较长。上世纪90年代，胚挽救技术的发展为无核葡萄育种带来了新途径，使无核葡萄作为母本进行杂交育种成为可能，不仅大幅度增加了后代无核的几率，也大大缩短了育种周期，在一定程度上解决了无核葡萄育种的难题，作为一种有效的无核葡萄育种方法受到育种家们的高度重视。但是在胚挽救过程中，品种基因型、取样接种时间、培养基种类与相态、植物生长调节剂、碳源、培养环境、移栽方式等都会对胚挽救的萌发率和成苗率产生影响，且各因子相互作用，并且南北方地区差异使得南方葡萄发育成熟早，胚败育最佳期不同，加大了对无核葡萄胚挽救技术体系构建的难度，导致了无核葡萄为母本杂交后果实中胚发育率低，胚挽救成苗不足已经成为制约南方无核葡萄育种效率的瓶颈，如何提高无核葡萄胚挽救育种的成苗率，扩大胚挽救植株群体，成为葡萄育种家的努力方向。
技术实现思路
本专利技术针对现有的缺点，公开了一种提高无核葡萄杂交胚挽救成苗的方法，从而有效地促进无核葡萄杂交胚发育，在离体组织培养条件下能发育成苗，且胚培养苗健壮整齐，迅速扩大植株群体，提高南方地区无核葡萄育种中胚挽救育种效率。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决。一种提高无核葡萄杂交胚挽救成苗的方法，包括以下步骤，A.摘心环剥：无核葡萄母本新稍长到6叶期，花序上留1叶进行摘心处理，在花前7-10天对顶副梢进行第二次摘心处理，其余副梢留1叶摘心，在初花期人工去雄前进行顶副梢摘心与结果枝的环剥；本专利技术中，无核葡萄母本新稍长到6叶期，花序上留1叶进行摘心处理，在花前7-10天对顶副梢进行第二次摘心处理，其余副梢留1叶摘心，起到以下技术效果：控制营养生长，促进花序发育。B.杂交后取样、低温处理后接种胚珠：在初花期进行人工去雄授粉，在授粉后杂交种子败育的最佳取果期摘取幼果，幼果取回后4-6℃低温处理，3天，剥取胚珠接种，选择加入第一外源添加物的B5液体培养基，25℃暗培养80-90天；C.取裸胚接种：取胚珠，胚珠纵切剥取白色裸胚，接种到加入了第二外源添加物的WPM培养基上，光培养；D.继代扩繁：将30-40天苗龄的胚挽救试管苗，双芽茎段接种在继代培养基1/2WPM上，继代培养基1/2WPM上加入第三外源添加物，外源添加物为0.1-0.5mg/L的IBA、20-40g/L的蔗糖、2-3g/L的活性炭，光培养得试管苗；E.炼苗：对试管苗进行炼苗。作为优选，步骤B中，授粉后杂交种子败育的最佳取果期为火焰无核葡萄和寒香蜜杂交为授粉后33-36天，或奥迪亚无核葡萄和碧香无核杂交为授粉后38-40天。步骤B中，在初花期进行人工去雄授粉，在授粉后杂交种子败育的最佳取果期摘取幼果，并进行低温处理，取出流水冲洗30min，然后于超净工作台用75％乙醇漂洗30s，无菌水冲洗1次，再将果粒放入升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗3-5次，剥取胚珠接种，选择B5液体培养基，25℃暗培养80-90天。作为优选，步骤B中，第一外源添加物为1-2.5mg/L的IBA、0.5-1.5mg/L的GA3、0.1-0.5mg/L的6-BA、50-65g/L的蔗糖、0.5-1.5g/L的活性炭。作为优选，步骤C中，第二外源添加物为0.4-0.8mg/L的6-BA、20-40g/L的蔗糖、1-2g/L的活性炭。作为优选，步骤E中，炼苗方式为，试管苗移到室内自然光条件下培养2天；打开瓶盖培养2天；取出试管苗、洗净根系上培养基，栽入已装好用70％甲基托布津和1000倍灭菌泥炭的营养钵中，苗上盖塑料杯保湿，时间为7天；移到设施条件下长出2片新叶后定植，苗床土壤用30％恶霉灵消毒，即得到无核葡萄杂交苗植株。本专利技术在炼苗过程中，试管苗移到室内自然光条件下培养2天，是为了适应光照。打开瓶盖培养2天是为了适应光照、温度与湿度变化。取出试管苗、洗净根系上培养基，栽入已装好用70％甲基托布津和1000倍灭菌泥炭的营养钵中，苗上盖塑料杯保湿培养，是为了适应光、温湿度与泥炭基质。移到设施条件下是进行移栽前的适应性锻炼。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术所采用的方法，能有效促进无核葡萄杂交胚在离体条件下继续发育，提高胚珠与胚发育率，促进胚萌发，增加了杂交后代成苗的基数，从而能得到更多的杂交后代，且继代扩繁后胚挽救苗健壮整齐，有助于降低因移栽死亡而造成的单株丢失风险与后期的鉴定。应用本专利技术所获得的无核葡萄杂交胚发育率高，胚挽救苗整齐健壮，胚发育率达到了41.7％，成苗率达到了18.3％，继代培养成苗率达到了92％，其中健壮苗与次健壮苗达到81.8％，试管苗移栽成活率达到了97％，大大提高了无核葡萄杂交后代胚挽救育种成苗的植株群体，提高了无核葡萄胚挽救育种效率，可操作性强、容易掌握。具体实施方式实施例1一种提高无核葡萄杂交胚挽救成苗的方法，包括以下步骤，A.摘心环剥：无核葡萄母本新稍长到6叶期，花序上留1叶进行摘心处理，在花前7天对顶副梢进行第二次摘心处理，其余副梢留1叶摘心，在初花期人工去雄前进行顶副梢摘心与结果枝的环剥；B.杂交后取样、低温处理后接种胚珠：在初花期进行人工去雄授粉，在授粉后杂交种子败育的最佳取果期摘取幼果，幼果取回后4℃低温处理，3天，剥取胚珠接种，选择加入第一外源添加物的B5液体培养基，25℃暗培养80天；C.取裸胚接种：取胚珠，胚珠纵切剥取白色裸胚，接种到加入了第二外源添加物的WPM培养基上，光培养；D.继代扩繁：将30天苗龄的胚挽救试管苗，双芽茎段接种在继代培养基1/2WPM上，继代培养基1/2WPM上加入第三外源添加物，外源添加物为0.1mg/L的IBA、20g/L的蔗糖、2g/L的活性炭，光培养得试管苗；E.炼苗：对试管苗进行炼苗。步骤B中，第一外源添加物为1mg/L的IBA、0.5mg/L的GA3、0.1mg/L的6-BA、50g/L的蔗糖、0.5g/L的活性炭。步骤C中，第二外源添加物为0.4mg/L的6-BA、20g/L的蔗糖、1g/L的活性炭。实施例2一种提高无核葡萄杂交胚挽救成苗的方法，包括以下步骤，A.摘心环剥：无核葡萄母本新稍长到6叶期，花序上留1叶进行摘心处理，在花前7-10天对顶副梢进行第二次摘心处理，其余副梢留1叶摘心，在初花期人工去雄前进行顶副梢摘心与结果枝的环剥；B.杂交后取样、低温处理后接种胚珠：在初花期进行人工去雄授粉，在授粉后杂交种子败育的最佳取果期摘取幼果，幼果取回后6℃低温处理，3天，剥取胚珠接种，选择加入第一外源添加物的B5液体培养基，25℃暗培养90天；C.取裸胚接种：取胚珠，胚珠纵切剥取白色裸胚，接种到加入了第二外源添加物的WPM培养基上，光培养；D.继代扩繁：将40天苗龄的胚挽救试管苗，双芽茎段接种在继代培养基1/2WPM上，继代培养基1/2WPM上加入第三外源添加物，外源添加物为0.5mg/L的IBA、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高无核葡萄杂交胚挽救成苗的方法，其特征在于：包括以下步骤，A.摘心环剥：无核葡萄母本新稍长到6叶期，花序上留1叶进行摘心处理，在花前7‑10天对顶副梢进行第二次摘心处理，其余副梢留1叶摘心，在初花期人工去雄前进行顶副梢摘心与结果枝的环剥；B.杂交后取样、低温处理后接种胚珠：在初花期进行人工去雄授粉，在授粉后杂交种子败育的最佳取果期摘取幼果，幼果取回后4‑6℃低温处理，3天，剥取胚珠接种，选择加入第一外源添加物的B5液体培养基，25℃暗培养80‑90天；C.取裸胚接种：取胚珠，胚珠纵切剥取白色裸胚，接种到加入了第二外源添加物的WPM培养基上，光培养；D.继代扩繁：将30‑40天苗龄的胚挽救试管苗，双芽茎段接种在继代培养基1/2WPM上，继代培养基1/2WPM上加入第三外源添加物，外源添加物为0.1‑0.5mg/L的IBA、20‑40g/L的蔗糖、2‑3g/L的活性炭，光培养得试管苗；E.炼苗：对试管苗进行炼苗。

【技术特征摘要】
1.一种提高无核葡萄杂交胚挽救成苗的方法，其特征在于：包括以下步骤，A.摘心环剥：无核葡萄母本新梢长到6叶期，花序上留1叶进行摘心处理，在花前7-10天对顶副梢进行第二次摘心处理，其余副梢留1叶摘心，在初花期人工去雄前进行顶副梢摘心与结果枝的环剥；B.杂交后取样、低温处理后接种胚珠：在初花期进行人工去雄授粉，在授粉后杂交种子败育的最佳取果期摘取幼果，幼果取回后4-6℃低温处理，3天，剥取胚珠接种，选择加入第一外源添加物的B5液体培养基，25℃暗培养80-90天，第一外源添加物为1-2.5mg/L的IBA、0.5-1.5mg/L的GA3、0.1-0.5mg/L的6-BA、50-65g/L的蔗糖、0.5-1.5g/L的活性炭；C.取裸胚接种：取胚珠，胚珠纵切剥取白色裸胚，接种到加入了第二外源添加物的WPM培养基上，光培养，第二外源添加物为0.4-0.8mg/L的6-BA、20-40g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：程建徽，郑婷，吴江，魏灵珠，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33