本发明专利技术公开了一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29及其获得方法，将实验室克隆得到的家蝇天蚕素抗菌肽与中国林蛙抗菌肽Chensirin作为母体肽，进行杂合设计，获得了低溶血、高抗菌活性的新型杂合肽及其高效表达的发酵菌株，与天然肽相比具有更大的优势，为抗菌肽的规模化生产奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和生物
，具体涉及一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗 菌肽CC29及其获得方法。
技术介绍
抗菌肽是生物先天性免疫系统的重要组成部分，是经免疫诱导产生的一类抵抗外 界病原体感染具有生物活性的小分子多肽。抗菌肽具有广谱抗菌作用，尤其是对一些产生 抗生素耐药性的病原菌的杀灭作用更引起了人们对它的兴趣。抗菌肽在农业、医疗、食品等 领域的应用潜力巨大。迄今为止，已经发现了上千种天然抗菌肽，但是具有较好的医疗选择 指数的种类却比较少，因此，如何能够获得抑菌效果好、产量高的抗菌肽一直受到研宄者的 普遍关注。目前，抗菌肽的获得方法主要有三种：（1)直接从生物体中提取天然肽，但含量 非常少，且提取工艺复杂，成本较高，难以满足大规模生产的要求；(2)化学方法合成。这种 方法只适用于非常短的抗菌肽，但大多数抗菌肽分子量都比较大，不适合化学合成；（3)分 子量比较大的抗菌肽大多都采用基因工程的方法，该方法研宄的比较透彻，而且是生产抗 菌肽的有效途径。因此，人们希望通过分子上的重新设计，例如，杂合肽的设计等方式从丰 富的天然抗菌肽资源中获得理想的新型人工抗菌肽。 杂合抗菌肽的设计特点是集两个（或以上）天然肽的优点于一身，经过适当的 人工修饰后，可以扬长避短，最大程度上发挥抗菌活性，并不引起溶血。天蚕素抗菌肽 (cecropins)是目前研宄最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家幡天蚕素抗菌肽（CecMd)是 本实验室经诱导家蝇幼虫，然后克隆得到的（同源性81%)。而Chensirin是近年来发现 的中国东北林蛙皮肤上分泌的天然抗菌肽，其活性很高，但具有较高的溶血活性。如果能够 对两者进行杂合设计，将会为抗菌肽的规模化生产奠定基础。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29及其 获得方法。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为： 一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29,所述抗菌肽CC29包括两对引物，其核 苷酸序列为：【主权项】1. 一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肤CC29,其特征在于，所述抗菌肤CC29包括两对 引物，其核巧酸序列为：所述核巧酸序列前端引入=肤序列，所述核巧酸序列两端各加入了Ba恤I和SalI限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，所述抗菌肤CC29的分子量为 3236. 00 ;电荷数为巧.5 ;等电点为11. 22 ;疏水力矩为0. 35。2. -种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肤CC29的获得方法，其特征在于，包括如下步 骤： 51、 根据Genbank中化ensirin序列W及实验室克隆得到的家蛹天蚕素抗菌肤序列，选 取具有潜力的片段进行组合，应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级 和S级结构和抗菌活性，筛选出医疗潜力指数最大的组合CC29,在其两端加上化0I和甜a I限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，合成两对引物F1、R1，F2、R2,应 用重叠PCR技术合成CC29融合蛋白基因； 52、 构建CC29克隆载体、pGAPZaA/CC29并测序鉴定，构建表达载体pGAPZaA/CC29并 测序鉴定，将重组的克隆pGAPZaA/CC29与表达载体pGAPZaA同时双酶切，获得的目的基 因与同样酶切的表达载体连接构建重组表达载体pGAPZaA/CC29,将杂合抗菌肤CC29表达 载体转化到宿主菌SMD1168中，获得杂合抗菌肤CC29的重组原核表达基因工程菌； 53、 使用IPTG对培养至对数期的杂合抗菌肤CC29大肠杆菌基因工程菌进行诱导，通过 SDS-PAGE和westernblot技术对CC29融合蛋白进行检测，W便确定其表达水平和表达方 式； 54、 将杂合抗菌肤基因构建在毕赤酵母表达载体pGAPZaA上，电转化到宿主菌 SMD1168后，使用YTO液体培养基培养3天，杂合抗菌肤表达出分泌蛋白；对表达载体表达 出的蛋白进行层析纯化，纯化后的融合蛋白经甲酸切割后去除标签，然后进行定量，纯化样 品保留； 55、CC29的生物学活性鉴定。3. 根据权利要求2所述的一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肤CC29的获得方法，其特 征在于，所述步骤S5过程中包括；将杂合抗菌肤CC29经沸水浴2min、5min、10min、30min和 60min的热稳定性检测；将杂合抗菌肤CC29在抑为1、2、5、7、10、12、14缓冲液中，W沙口 氏菌为指示菌的杀菌活性检测；通过抑菌圈法和连续倍比稀释法测定杂合抗菌肤CC29对 大肠杆菌、乳酸杆菌、鸡沙口氏菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性和最小抑菌浓 度；采用红细胞血红素的释放测定杂合抗菌肤CC29的溶血活性。【专利摘要】本专利技术公开了一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29及其获得方法，将实验室克隆得到的家蝇天蚕素抗菌肽与中国林蛙抗菌肽Chensirin作为母体肽，进行杂合设计，获得了低溶血、高抗菌活性的新型杂合肽及其高效表达的发酵菌株，与天然肽相比具有更大的优势，为抗菌肽的规模化生产奠定基础。【IPC分类】C07K19-00, C12N15-81【公开号】CN104788568【申请号】CN201510027047【专利技术人】张爱忠, 姜宁, 张晨雪, 蔡鹏 , 朱双, 刘晓明, 祁丽 【申请人】黑龙江八一农垦大学【公开日】2015年7月22日【申请日】2015年1月16日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29，其特征在于，所述抗菌肽CC29包括两对引物，其核苷酸序列为：CCGTTGGTTGAAGAAGTTGGGTAAGAAGTTGAAGGCTGGTCAACACACTTTGTTGCCATTGCCATTGGGTTACTTCGCTAAGAAGACTCTAG所述核苷酸序列前端引入三肽序列，所述核苷酸序列两端各加入了BamH I和Sal I限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，所述抗菌肽CC29的分子量为3236.00；电荷数为+7.5；等电点为11.22；疏水力矩为0.35。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张爱忠，姜宁，张晨雪，蔡鹏，朱双，刘晓明，祁丽，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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