本发明专利技术公开了一种检测TLR2/4介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物，序列如下：用于对TLR2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，该序列与猪TLR2mRNA的一段互补。本发明专利技术的有益效果是：TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子的差异表达在抗病毒的研究中有着至关重要的作用，对病毒性疾病的防治具有重要意义。通过本发明专利技术设计，各种引物的反应温度都进行了标准化，片段长度也进行了标准化，所有的mRNA定量均可以在相同条件下完成，使不同的实验间具有可比性。
【技术实现步骤摘要】
检测TLR2/4介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物、扩增程序及定量试剂盒
本专利技术涉及生物
，是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的分子生物学方法，特别是涉及荧光定量聚合酶链式反应（Q-PCR）。
技术介绍
NF-κB信号通路的作用十分广泛，尤其是在天然抗病毒免疫防御中起到重要的作用。根据目前的研究表明，病毒可以通过激活NF-κB信号通路，进而诱导固有免疫功能改变，目前研究病毒致病或者感染机制中更注重宿主在病毒感染过程中免疫反应变化。在病毒感染机体后，快速有效的检测NF-κB通路中关键分子的差异性表达对我们研究病毒的感染机制是非常必要的，但是目前的检测方法由于技术缺陷、操作繁琐、试验时间长、无标准化、成本高等原因让试验者面临很大的困难。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发出一种准确、快速、简单费用低廉的检测TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子mRNA表达水平的技术。本专利技术基于荧光定量，通过一整套的特异引物进行荧光定量分析，进行相对定量的检测，解决了目前对TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子快速检测的技术瓶颈。同时，我们对检测的关键分子在96孔板上进行合理排布，使其得到更加充分的利用，能过更加高效的进行研究分析。本专利技术的技术方案是：一种检测TLR2/4介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物，序列如下：用于对TLR2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示，该序列与猪TLR2mRNA的一段互补；用于对TLR4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示，该序列与猪TLR4mRNA的一段互补；用于对TIRAP进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：5、SEQIDNO：6所示，该序列与猪TIRAPmRNA的一段互补；用于对IRAK1进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：7、SEQIDNO：8所示，该序列与猪IRAK1mRNA的一段互补；用于对IRAK4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：9、SEQIDNO：10所示，该序列与猪IRAK4mRNA的一段互补；用于对TRAF6进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：11、SEQIDNO：12所示，该序列与猪TRAF6mRNA的一段互补；用于对MyD88进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：13、SEQIDNO：14所示，该序列与猪MyD88mRNA的一段互补；用于对TAK1进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：15、SEQIDNO：16所示，该序列与猪TAK1mRNA的一段互补；用于对TAB2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：17、SEQIDNO：18所示，该序列与猪TAB2mRNA的一段互补；用于对TAB3进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：19、SEQIDNO：20所示，该序列与猪TAB3mRNA的一段互补；用于对RELA进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：21、SEQIDNO：22所示，该序列与猪RELAmRNA的一段互补；用于对IκBα进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：23、SEQIDNO：24所示，该序列与猪IκBαmRNA的一段互补；用于对IKKα进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：25、SEQIDNO：26所示，该序列与猪IKKαmRNA的一段互补；用于对TRIF进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：27、SEQIDNO：28所示，该序列与猪TRIFmRNA的一段互补；用于β-Actin对进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：29、SEQIDNO：30所示，该序列与猪β-ActinmRNA的一段互补。一种检测TLR2/4介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的扩增程序，95℃预变性30s；进行40个循环扩增：95℃变性15s，60℃延伸30s，同时采集荧光信号强度。含有权利要求1所述的检测TLR2/4介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物的定量试剂盒，试剂盒包含荧光定量反应预混酶和含有引物的荧光定量96孔反应板，试剂盒由下述部分组成：2.5mL荧光定量预混酶；3mL无菌水；含有特异性引物的PCR96孔反应板一块。一种快速检测对TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子相对含量的技术，可以反映机体或者是体外培养的细胞在病毒感染的不同阶段NF-κB信号通路中关键分子的表达情况。设计了15对特异性引物，分别为：TLR2、TLR4、TIRAP、IRAK1、IRAK4、TRAF6、MyD88、TAK1、TAB2、TAB3、TRIF、IKKα、RELA、IκBα、β-Actin。配套此检测的内参引物β-Actin，用于荧光定量分析。mRNA检测扩增程序，用于TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子TLR2、TLR4、TIRAP、IRAK1、IRAK4、TRAF6、MyD88、TAK1、TAB2、TAB3、TRIF、IKKα、RELA、IκBα、β-Actin的检测，以达到同时检测15种关键分子的目的。一种用于TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子检测的相对定量检测试剂盒，试剂盒内荧光定量反应预混酶和荧光定量反应96孔板，试剂盒由下述试剂组成：2.5mL荧光定量预混酶；3mL无菌水；含有引物的PCR96孔反应板一块。本专利技术的有益效果是：TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子的差异表达在抗病毒的研究中有着至关重要的作用，对病毒性疾病的防治具有重要意义。已经表明，多种病毒性疾病在感染机体的过程中引起TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子mRNA表达，通过本专利技术设计，各种引物的反应温度都进行了标准化，片段长度也进行了标准化，所有的mRNA定量均可以在相同条件下完成，使不同的实验间具有可比性。本专利技术能够建立在mRNA检测的荧光定量PCR技术平台上，不仅可以缩短实验时间，减少实验经费使用，提高实验结果的准确性和说服力，提供一个全新的检测标准和评估体系。通过病毒感染后组织采样或者人工培养细胞系快速完成总RNA的提取，并于荧光定量PCR上进行检测。总结也上过程可以发现，此方法可以有效的缩短实验时间、减少经费的使用等。通过优化的实验反应体系和反应条件，组成检测灵敏、方便的试剂盒，为检测TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子提供可靠的检测技术。通过建立荧光定量PCR技术平台，开发出便捷的检测方法。该方法依靠PCR技术的高灵敏性和荧光定量技术，可以一次性对TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中的多个关键分子基因进行相对定量，检测病毒感染后不同时期TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子的表达量的差异，并通过荧光定量的方法将结果直观的表现出来，以更加简便快捷的研究病毒的致病机制。通过对感染病毒机体组织或者体外感染细胞，完成RNA的提取，在荧光定量PCR仪上进行检测，快速获得结果。这本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测TLR2/4介导的NF‑κB信号通路中关键分子含量的特异性引物，其特征在于序列如下：用于对TLR2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，该序列与猪TLR2mRNA的一段互补；用于对TLR4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示，该序列与猪TLR4mRNA的一段互补；用于对TIRAP进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示，该序列与猪TIRAP mRNA的一段互补；用于对IRAK1进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示，该序列与猪IRAK1mRNA的一段互补；用于对IRAK4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示，该序列与猪IRAK4 mRNA的一段互补；用于对TRAF6进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示，该序列与猪TRAF6 mRNA的一段互补；用于对MyD88进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示，该序列与猪MyD88 mRNA的一段互补；用于对TAK1进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示，该序列与猪TAK1 mRNA的一段互补；用于对TAB2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18所示，该序列与猪TAB2 mRNA的一段互补；用于对TAB3进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20所示，该序列与猪TAB3 mRNA的一段互补；用于对RELA进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22所示，该序列与猪RELA mRNA的一段互补；用于对IκBα进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24所示，该序列与猪IκBα mRNA的一段互补；用于对IKKα进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26所示，该序列与猪IKKα mRNA的一段互补；用于对TRIF进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28所示，该序列与猪TRIF mRNA的一段互补；用于β‑Actin对进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30所示，该序列与猪β‑Actin mRNA的一段互补。...
【技术特征摘要】
1.一种检测TLR2/4介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物组，其特征在于序列如下：用于对TLR2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示，该序列与猪TLR2mRNA的一段互补；用于对TLR4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示，该序列与猪TLR4mRNA的一段互补；用于对TIRAP进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：5、SEQIDNO：6所示，该序列与猪TIRAPmRNA的一段互补；用于对IRAK1进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：7、SEQIDNO：8所示，该序列与猪IRAK1mRNA的一段互补；用于对IRAK4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：9、SEQIDNO：10所示，该序列与猪IRAK4mRNA的一段互补；用于对TRAF6进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：11、SEQIDNO：12所示，该序列与猪TRAF6mRNA的一段互补；用于对MyD88进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：13、SEQIDNO：14所示，该序列与猪MyD88mRNA的一段互补；用于对TAK1进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO：15、SEQIDNO：16所示，该序列与猪TAK1mRNA的一段互补...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋月，魏战勇，杨国宇，徐端红，索江华，郑兰兰，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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