一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，包括以下步骤：1)供试番茄顶芽样品前处理；2)配制流动相、设置色谱条件；3)标准液的制备；4)专属性考察；5)线性关系考察；6)样品含量测定；步骤1)的方法包括提取、石油醚萃取后进行减压蒸发，再调节pH，并经乙酸乙酯萃取后，最后经二次减压蒸发制成样品待测液；步骤2)中流动相为甲醇与0.075％冰乙酸配制而成。本发明专利技术提供的HPLC法测定番茄顶芽内源激素含量的方法，可快速、准确、同时测定4种植物内源激素的含量，具有测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点；进行加标回收率实验，平均回收率为99.85％，RSD小于1.56％，符合激素测定要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及农学中作物内源激素
，具体涉及一种用于高效液相色谱法 (HPLC)测定番茄植株顶芽内源激素含量的方法。
技术介绍
番前（Lycopersiconesculentum)是世界和中国主要设施作物之一，因其口味佳、 营养丰富而深受广大消费者的喜爱。我国设施番茄栽培面积及产量均居世界首位。目前关 于设施番茄的科学研宄，多集中在形态指标、光合特性及干物质分配等方面。通过分子机理 的研宄，深入认识植物激素调控设施番茄生长、发育及其对环境适应的机制，具有重要的科 学意义。 植物激素（planthormone,PH)是指在植物体的某一部位合成，可转移到其他部 位，并对植物的生长发育具有显著调节作用的微量有机物，亦称植物天然激素或内源激素。 其特点是：（1)内源性：植物自身合成；（2)能从合成部位运往作用部位；（3)在极低浓度下 发挥作用：参与细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发等 生理过程。生长素、赤霉素、细胞分裂素和脱落酸是植物体内四种重要的生长激素；植物内 源激素种类多，含量甚微，且易被破坏。 目前关于番茄顶芽和叶片的内源激素测定方法有间接酶联免疫吸附法（ELISA) (生吉萍等，2000 ;乔志霞，2004 ;阮英，2005 ;朱延姝和冯辉，2005 ;贺忠群等，2010)，高效液 相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，简称HPLC)是一种区别于经典液相 色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，因其高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，广泛 用于各个领域，也是目前用于番茄内源激素测定的重要方法。目前关于利用高效液相色谱 法测定番茄顶芽的内源激素的方法未见报道，本专利技术主要解决了在利用高效液相色谱法测 定番茄顶芽激素时，探索番茄顶芽样品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用 HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法。 已有番茄顶芽内源激素测定方法是间接酶联免疫吸附法（ELISA)，其基本方法是 将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体 反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。但需要购买酶联免疫试剂盒，对 试验条件高。高效液相色谱法测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，但对配制流动 相、设置色谱条件要求较高，目前没有一种适合高效液相色谱法测定番茄顶芽内源激素的 样品前处理、流动相、设置色谱条件的方法。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种适合高效液相色谱 法测定番茄顶芽内源激素含量的样品前处理、流动相及设置色谱条件的方法，具有测定快 速、高效、高灵敏度、高自动化的特点。 技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： -种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，包括以下步骤： 1)供试番茄顶芽样品前处理；2)配制流动相、设置色谱条件；3)标准液的制备； 4)专属性考察；5)线性关系考察；6)样品含量测定； 所述步骤1)的方法包括提取、石油醚萃取后进行减压蒸发，再调节pH，并经乙酸 乙酯萃取后，最后经二次减压蒸发制成样品待测液； 所述步骤2)中流动相为甲醇与0. 075 %冰乙酸配制而成； 所述标准液和所述样品含量测定的植物激素包括IAA、ZT、ABA和GA3。 进一步的，在本专利技术中，所述步骤1)的具体方法包括： 1-1)提取：供试番茄顶芽样品加入冷甲醇中，于4°C下静置16h浸提，抽滤得清液， 得粗提取液； 1-2)石油醚萃取：将所述粗提取液用等体积石油醚萃取，弃去醚相，合并水相； 1-3)减压蒸发：将步骤1-2)所得的所述水相在37°C下旋转蒸发至所述水相体积 的1/3~1/4,得一次浓缩液； 1-4)调节pH:将所述一次浓缩液调节pH至2. 75~2. 85之间； 1-5)乙酸乙酯萃取：将调节好pH的一次浓缩液用等体积乙酸乙酯萃取，弃去水 相，合并酯相； 1-6)二次减压蒸发：将步骤1-5)所得的所述酯相在37°C下旋转蒸发至所述酯相 体积的1/4~1/5,得二次浓缩液，用甲醇定容至所述二次浓缩液体积的2倍，制成样品待测 液，保存于4°C下棕色瓶中，待测。 进一步的，在本专利技术中，所述步骤2)中所述流动相为：甲醇与0. 075%冰乙酸按体 积比为45 :55配制流动相。 进一步的，在本专利技术中，所述步骤2)中，色谱条件设置为检测波长210nm，流速为 0? 7mL/min，进样量为 20yL。 进一步的，在本专利技术中，步骤3)中，所述标准液包括：0.lg/L的IAA标准液、 0. 001g/L的ZT标准液、0. 001g/L的ABA标准液和0. 01g/L的GA3#准液；将所述标准液按 照不同浓度配比，配制成系列浓度梯度的标准混合溶液，4°C保存。 进一步的，在本专利技术中，所述步骤4)中，在步骤2)所述的色谱条件下，专属性考察 包括对所述番茄顶芽样品中的IAA、ZT、ABA和GA3进行HPLC分离检测。 进一步的，在本专利技术中，所述步骤5)的具体方法为：分别量取经所述步骤3)制成 的IAA、ZT、ABA和GA#准液各lmL，在IOmL的棕色容量瓶中用甲醇定容，过滤、进样并检 测，以4种混标峰面积与相应质量浓度进行线性回归分析。 进一步的，在本专利技术中，所述步骤6)的具体方法为：将步骤1)制成的所述样品待 测液，过滤进样，按外标法以峰面积计算所述番茄顶芽样品中IAA、ZT、ABA和6^的含量。 进一步的，在本专利技术中，完成所述步骤6)后，进行加标回收率试验，具体方法为： 分别配制0. 〇lg/L的IAA、ZT、ABA和GA3二号标准液，4°C保存；将步骤1)制成的所述样品 待测液中分别加入等体积的所述二号标准液，按外标法以峰面积测定植物激素含量，计算 加标回收率。 有益效果：本专利技术提供的高效液相色谱法测定番茄顶芽内源激素含量的方法，可 快速、准确、同时测定4种植物内源激素（IAA、ZT、ABA和GA3)的含量，具有测定快速、高 效、高灵敏度、高自动化的特点，填补了现有技术中缺乏高效液相色谱法测定番茄顶芽激素 的测定方法的空白，为此领域的技术人员提供了应用基础和提示；此外，进行加标回收率实 验，平均回收率为99. 85%，RSD小于1. 56%，符合激素测定要求。【附图说明】 图1为本专利技术的测定方法流程图； 图2为本专利技术的标准液的色谱测试结果图； 图3为本专利技术的样品待测液的色谱测试结果图。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术作更进一步的说明。 如图1所示为本专利技术的测定方法流程图，一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定 方法，包括以下步骤： 1)供试番茄顶芽样品前处理，包括提取、石油醚萃取后进行减压蒸发，再调节pH， 并经乙酸乙酯萃取后，最后经二次减压蒸发制成样品待测液；具体方法包括： 1-1)提取：供试番茄顶芽样品Ig加入80%冷甲醇中，于4°C下静置16h浸提，抽 滤得清液，得粗提取液； 1-2)石油醚萃取：将粗提取液用等体积石油醚萃取，弃去醚相，合并水相； 1-3)减压蒸发：将步骤1-2)所得的水相在37°C下旋转蒸发至水相体积的1/3~ 1/4,得一次浓缩液； 1-4)调节pH:将一次浓缩液调节pH至2. 75~本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种番茄植株顶芽内源激素含量的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：1)供试番茄顶芽样品前处理；2)配制流动相、设置色谱条件；3)标准液的制备；4)专属性考察；5)线性关系考察；6)样品含量测定；所述步骤1)的方法包括提取、石油醚萃取后进行减压蒸发，再调节pH，并经乙酸乙酯萃取后，最后经二次减压蒸发制成样品待测液；所述步骤2)中流动相为甲醇与0.075％冰乙酸配制而成；所述标准液和所述样品含量测定的植物激素包括IAA、ZT、ABA和GA3。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨再强，袁昌洪，邱译萱，
申请(专利权)人：南京信息工程大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32