用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一组用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子及其应用，通过SELEX方法成功筛选了特异性识别蛋白质CTGF全长及N端或者C端氨基酸片段的核酸适配子。结果表明，经人工合成大量制备的核酸适配子可以特异性识别并结合蛋白质CTGF全长及氨基酸片段，且具有较高的特异性及灵敏性。核酸适配子在亲和力和特异性方面可与抗体媲美，甚至优于抗体，有望被开发成为体内外检测蛋白质CTGF的全长及N端或者C端氨基酸片段的有力工具。

【技术实现步骤摘要】
用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子及其应用
本专利技术属于蛋白质检测
，具体涉及一组用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子及其应用。
技术介绍
结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)，是新近发现的一种强力的促进肝纤维化因子，在肝纤维化发生发展过程中起着中心作用。CTGF是分泌型蛋白，是高度保守的CCN家族成员之一，具有促进细胞增殖，促进细胞外基质沉积，介导细胞粘附，刺激细胞迁移，促进软骨形成及骨骼发育等多种生物学作用。CTGF在肝纤维化肝组织中表达上调，其表达水平与肝纤维化程度正相关。指数富集式配体系统进化技术(SELEX)技术是90年代建立的一项筛选技术，基本思想是：体外化学合成一个单链寡核苷酸库，由于每个不同序列的单链核酸可以自身折叠形成特异的二级结构，不同二级结构的单链核酸就有可能与不同靶分子或一个靶分子中的不同位点依照热力学原理结合，从而筛选出与靶分子结合的短链核酸即特异的适配子。基本过程为，将随机寡核苷酸文库与靶物质混合，使靶物质与核酸结合，然后洗掉未与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下一轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的DNA或RNA分子被洗去，而与靶物质高有亲和力的DNA分子或RNA分子从非常大的随机库中分离出来，且纯度随过程的进行而增高，最后占据产物的大多数，称之为适配子。核酸适配子在亲和力和特异性方面可与抗体媲美，甚至优于抗体，并且具有抗体所不具备的其他一些优点：①靶分子范围更广，几乎没有任何限制。目前筛选适配子的靶分子包括金属离子、小分子化合物、糖类、核酸、碱基类似物、多肽与蛋白质、甚至完整的病毒颗粒、致病菌和活细胞等等。②适配子通过体外筛选，不依靠动物、细胞及内环境，毒素和毒素结合位点也可作为靶标；③适配子筛选周期更短，筛选过程已经自动化，能应用于大规模的工业生产；④适配子稳定性好,可长期保存,能在常温下运输；⑤化学合成的适配子精确度高，重复性强，生产中很少存在批次间的差异；⑥结合能力强。甚至强于天然配基,解离常数(Kd)多在pmol/L－nmol/L之间；⑦适配子没有免疫原性，没有毒性和明显的副作用。可用于体内诊断或治疗；⑧报告子如荧光素或生物素等可与适配子精确地结合在操作者能识别的位点上；⑧结合特异性强。通过反向SELEX筛选，可以有效减弱以至消除既与靶分子结合、又与靶分子类似物结合的核酸分子，从而筛选出高度特异结合靶分子的适配子。适配子能够分辨出靶分子结构上细微的差别，甚至可以区分1个甲基或1个羟基的差别。核苷酸、氨基酸的适配子能将它们与突变体、镜像体区分开来。⑨便于修饰。可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一组用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子及其应用。本专利技术是通过以下技术方案来实现：用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子，所述核酸适配子的核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示。在所述核酸适配子的核苷酸的5′端或3′端带有生物素标签。核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的核酸适配子命名为C-ap11，其结构为：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示的核酸适配子命名为C-ap12，其结构为：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示的核酸适配子命名为C-ap14，其结构为：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示的核酸适配子命名为C-ap15，其结构为：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示的核酸适配子命名为C-ap17p，其结构为：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示的核酸适配子命名为C-ap18，其结构为：所述核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18特异性识别CTGF全长及C末端氨基酸片段。所述核酸适配子C-ap17P特异性识别CTGF全长及N末端氨基酸片段。核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示的核酸适配子在制备识别结缔组织生长因子的检测试剂中的应用。核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示的核酸适配子在制备识别结缔组织生长因子的检测试剂盒中的应用。含有核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示的核酸适配子的检测试剂。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术公开了一种识别蛋白质CTGF的核酸适配子序列，通过SELEX方法成功筛选了特异性识别蛋白质CTGF全长及氨基酸片段的核酸适配子。经过生物素标记后的核酸适配子可以应用于特异性识别并结合重组人CTGF的全长及N末端或者C末端氨基酸片段。结果表明，经人工合成大量制备的核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18可以特异性识别CTGF全长及C末端氨基酸片段，其中C-ap12，C-ap14，C-ap15及C-ap18具有很强的结合能力；C-ap17P可以特异性识别CTGF全长及N末端氨基酸片段且具有很强的结合能力。因此，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap18及C-ap17P有望被开发为CTGF全长及N末端及C末端氨基酸片段的体外检测试剂盒，且可能具有较高的特异性及灵敏性。附图说明图1为筛选的核酸适配子与重组人CTGF结合图；图2为与重组人CTGF特异性结合印迹图；图3-1至图3-6分别为筛选的核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17及C-ap18结合重组人CTGF的解离常数分析图；图4-1至图4-6为筛选的核酸适配子C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17及C-ap18二级结构图；图5为带有固定序列的C-ap17P与无固定序列的C-ap17特异性结合印迹图；图6-1，图6-2分别为带有固定序列的C-ap17P与无固定序列的C-ap17结合重组人CTGF的解离常数分析图；图7-1，图7-2分别为带有固定序列的C-ap17P与无固定序列的C-ap17结合重组人CTGF的二级结构图；图8-1，图8-2分别为CTGF的氨基末端及羧基末端片段的原核表达及纯化图；图9为C-ap11，C-ap12，C-ap14，C-ap15，C-ap17P及C-ap18图与CTGF的氨基末端及羧基末端片段特异性结合图；图10为C-ap17P在体外细胞培养基中的生物稳定性分析图。具体实施方式本专利技术提供一种通过SELEX技术筛选的特异性识别重组人CTGF的新分子，成功筛选了识别重组人CTGF的核酸适配子，人工合成的随机的单链DNA文库通过SELEX方法筛选出与重组人CTGF特异性结合的单链D本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子，其特征在于，所述核酸适配子的核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.用于识别结缔组织生长因子的核酸适配子，其特征在于，所述核酸适配子的核酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5或SEQ.ID.NO.6所示；在所述核酸适配子的核苷酸的5′端或3′端带有生物素标签；核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示的核酸适配子命名为C-ap11，其结构为：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示的核酸适配子命名为C-ap12，其结构为：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示的核酸适配子命名为C-ap14，其结构为：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示的核酸适配子命名为C-ap15，其结构为：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示的核酸适配...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝志明，李爽，张倩楠，吕颐菲，霍涌玮，田宏，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：陕西;61