一种嗜水气单胞菌检测方法技术

本发明专利技术公开了一种嗜水气单胞菌检测方法。步骤包括，兔抗嗜水气单胞菌血清的制备；采用SPA亲和层析柱对兔抗嗜水气单胞菌血清进行纯化得到兔抗IgG；生物素标记兔抗IgG的制备；生物素-链霉亲和素的时间分辨荧光免疫检测；以分析缓冲液代替菌悬液作为阴性对照，比较时间分辨荧光TRF，以样品孔的TRF值与对照孔的TRF值之比大于2时判断为阳性结果；小于2时，判断为阴性结果。本发明专利技术在控制解离时间消除颗粒性抗原干扰的基础上，引入生物素-链霉亲和素信号放大系统检测嗜水气单胞菌，灵敏度达到1.0×102cfu/mL。同时时间分辨荧光TRF对数与菌浓度对数呈线性关系，可进行嗜水气单胞菌的定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物病原菌的检测方法，尤其涉及一种高灵敏度的嗜水气单胞菌检 测方法，具体为嗜水气单胞菌的生物素-链霉亲和素 TRFIA检测方法。
技术介绍
生物素-链霉亲和素系统是20世纪70年代后期应用于免疫学的一种新型生物反 应放大系统。生物素（Biotin)是动植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，经化学修饰 后成为带有多种活性基团的衍生物，活化生物素可以与各种蛋白质（如抗体、酶）结合。链 霉亲和素是由链霉菌（streptomyces avidinii)分泌的一种蛋白质，链霉亲和素分子由4 条相同的肽链组成，每个链霉亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强，比 抗原与抗体间的亲和力至少高1万倍。生物素-链霉亲和素系统具有的多级放大独特效 应，可极大地提高分析测定的灵敏度；二者之间的高亲和、高特异结合以及既可偶联生物大 分子，又可连接标记材料的特性，使该系统在标记免疫分析
中具有很强的适用性 (宋耀虹，等.生物素-链霉亲和素免疫学法测定地高辛的研宄.生物化学与生物物理进 展，1997, 24:265 - 567)。 免疫检测法由于操作简单、特异性强而得到应用，但酶联免疫吸附法（ELISA)和 荧光抗体法灵敏度不高，时间分辨荧光免疫检测（TRFIA)用长寿命的荧光物质标记，可有 效消除背景荧光干扰，从而提高灵敏度，但由于病原菌为颗粒性抗原，会干扰荧光的测定， 因此TRFIA法检测病原菌报道不多（卢洁，等.时间分辨荧光免疫法检测日本鳗麵产酸克 雷伯氏菌，分析化学，2012, 40:1709-1714)，而采用生物素-链霉亲和素的TRFIA法高灵敏 检测嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)从未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测灵敏度高，特异性强，稳定性好的嗜水气单胞菌 检测方法。 为实现上述目的，本专利技术提供，其特征在于，包括如下 步骤， 1)兔抗嗜水气单胞菌血清的制备； 2)亲和纯化制备兔抗IgG :采用SPA亲和层析柱对兔抗嗜水气单胞菌血清进行纯 化得到兔抗IgG ; 3)生物素标记兔抗IgG的制备； 4)生物素-链霉亲和素的TRFIA检测； 5)根据结果判断。 根据本专利技术的实施例，所述1)为，取嗜水气单胞菌菌株，免疫新西兰大白兔得到 兔抗嗜水气单胞菌血清；所述嗜水气单胞菌菌株的保藏号为CCTCC M 2015101 ; 优选的，具体步骤为， (1)将嗜水气单胞菌菌株接种于质量体积比0. 5% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液 中，27°C培养24h，用甲醛及加热两种方法灭活，离心，再加入无菌生理盐水洗涤，调整细菌 浓度至6. OX 108cfu/mL备用； (2)选择2只健康的2-3kg的新西兰大白兔，背部两侧皮下多点注射免疫，分4次 免疫，免疫间隔期为2周，第1次免疫时与弗氏完全佐剂I : 1体积比混合、乳化，第2次免 疫时与弗氏不完全佐剂I : 1体积比混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射 剂量为ImL ; (3)最后一次免疫10天后，耳静脉采血，分离血清，用试管凝集法测定抗血清效 价，效价达到1 : 1280以上方可使用。 根据本专利技术的实施例，在步骤（1)中，所述离心的条件采用为4500r/min，5min。 根据本专利技术的实施例，所述2)为，将ImL SPA亲和层析柱恢复室温，用10倍柱体 积的超纯水洗出柱中保护液，然后用10倍柱体积的0. 02mol/L pH7. 4的PBS缓冲液平衡柱 子；用注射器注入所述ImL兔抗嗜水气单胞菌血清与ImL PBS缓冲液混匀后的混合物，孵育 5min。用10倍体积的0. 02mol/LpH7. 4的PBS缓冲液洗脱杂蛋白，收集洗脱液。用10倍体 积的0. lmol/L pH3. 0的柠檬酸盐缓冲液洗脱兔抗嗜水气单胞菌血清，收集样品每管lmL， 每管收集前均加入200 μ L lmol/L pH9. 0的Tris-HCL缓冲液，所得即为兔抗IgG。 根据本专利技术的实施例，所述3)为，亲和纯化后的兔抗IgG用超纯水透析后，再冻干 机冻干；取冻干兔抗IgG溶于PBS，取Sulf 0-NHS-LC-Biotin水溶液加入所述兔抗IgG溶液 中，4°C反应；用Zeba Desalt Spin Columns柱纯化生物素标记的兔抗IgG ; 优选的，所述3)为，用超纯水4°C透析亲和纯化后的兔抗IgG 24h，其间换透析液 两次，冻干机冻干；取2mg冻干兔抗IgG溶于ImL 0.15mol/L pH 7.2的？133;称取2.211^ Sulfo-NHS-LC-Biotin溶于400 μ L超纯水中，取其中的26. 9 μ L加于兔抗IgG溶液中，4°C 反应2h ;用Zeba Desalt Spin Columns柱纯化生物素标记的兔抗IgG。 根据本专利技术的实施例，所得到的生物素标记兔抗IgG中，Sulfo-NHS-LC-Biotin和 IgG的分子数之比为2. 87。 根据本专利技术的实施例，还包括在3)之前进行抗嗜水气单胞菌IgG的纯度鉴定步 骤。 根据本专利技术的实施例，所述4)为，用pH 9.6,0.05mol/L的碳酸盐包被液稀释纯 化后的兔抗IgG，加入到96孔微孔板中，每孔100 yL，4°C包被12h ;洗涤液洗涤3次，每次 3min ;每孔加入200 μ L的1 % BSA，37°C封闭2h ;洗涤液洗涤3次，每次3min ;每孔加入分 析缓冲液稀释的待测菌悬液100 μ L，37°C振荡孵育Ih ;洗涤液洗涤3次，每次3min ;每孔加 入工作浓度的生物素标记兔抗IgG溶液100 μ L，37°C振荡孵育Ih ;洗涤液洗涤3次，每次 3min ;加入工作浓度的Eu3+-链霉亲和素溶液100 μ L，37°C振荡孵育lh，每次3min ;洗涤液 洗涤6次，每次3min ;每孔加入200 μ L增强液，室温振荡IOmin ;多标记分析仪上测量时间 分辨荧光TRF ; 所述碳酸盐包被液为Na2CO3L 49g，NaHC032. 93g，NaN3O. 2g，去离子H2O定容至IL ; 所述分析缓冲液为 Tris-base 6. 057g，Tween-201mL，BSA 2g，DTPA 0· 0196g， NaC19g，NaN3O. 5g，去离子H2O定容至800mL，浓盐酸调pH值到7. 8,去离子H2O定容至IL ; 所述洗绦缓冲液通过以下组分制备：Tris_base 6. 057g，Tween_202mL，NaCl 9g， NaN3O. 5g，去离子H2O定容至800mL，浓盐酸调pH值到7. 8,去离子H2O定容至IL ; 所述增强液通过以下组分制备：Triton X-lOOlmL，β -NTA 3. 99mg，TOPO 19. 33mg，邻苯二甲酸氢钾I. 3g，冰醋酸6mL，去离子H2O定容至1L。 根据本专利技术的实施例，所述4)中工作浓度的生物素标记兔抗IgG溶液浓度为 100ng/mL 〇 根据本专利技术的实施例，所述5)根据结果判断为，以分析缓冲液代替菌悬液作为阴 性对照，比较时间分辨荧光TRF，以样品孔的TRF值（P)与对照孔的TRF值（N)之比大于 2(即P/N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嗜水气单胞菌检测方法，其特征在于，包括如下步骤，1)兔抗嗜水气单胞菌血清的制备；2)亲和纯化制备兔抗IgG：采用SPA亲和层析柱对兔抗嗜水气单胞菌血清进行纯化得到兔抗IgG；3)生物素标记兔抗IgG的制备；4)生物素‑链霉亲和素的时间分辨荧光免疫检测；5)根据结果判断。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林鹏，郭松林，冯建军，卢洁，王艺磊，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35